HBV/HEV融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

　　　　 作者：何秀霞， 于源华*， 张春兰， 荀恒杰

【摘要】 　　目的: 构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价抗原的重组原核表达载体， 并在E.coli BL21(DE3)中表达。方法: 采用PCR方法扩增出HBV的S基因和HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414～606 aa的基因片段， 将两片段连接后克隆入T载体， 得到融合基因， 将融合基因克隆入含有Ω增强子的pTΩTE高效的原核表达载体中， 构建重组质粒pTΩT7SE。 将pTΩT7SE转化E.coli BL21(DE3)， 经IPTG诱导后用Western blot鉴定融合蛋白。结果: 获得全长为1 284 bp 的融合的HBV/HEV的基因片段。已构建的重组质粒pTΩT7SE转化E.coli BL21(DE3)后， 经IPTG诱导， 表达出相对分子质量（Mr）约为50 000重组蛋白。SDSPAGE分析显示， 表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于胞质中， 表达量约占全菌蛋白的30.52%。Western blot结果表明在Mr为50 000处可见特异性着色带。结论: 成功构建了原核表达载体pTΩT7SE， 并表达出目的蛋白， 为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础。

【关键词】 HBV HEV 重组原核表达载体 二价疫苗

　　乙型肝炎（HBV）是危害全球人类健康最重要的传染病之一， 它除能够诱发急性或慢性肝炎外， 还与人的肝硬化和肝癌等死亡率极高的疾病有直接的关系[1，2]。世界卫生组织估计2000年全球慢性HBV携带者达4亿人[3，4]， 其中有可能发展为肝细胞癌。而戊型肝炎（HEV）病毒是戊型病毒性肝炎的病原体， 主要经消化道传播， 常通过饮用被HEV污染的水源而引起爆发性流行， 主要累及一些发展中国家， 散发性病例呈全球性分布。HEV对HBV的复制无影响， 但HEV感染会加重乙肝患者肝脏损害和临床症状， 并可推测HEV对乙型肝炎发展有促进作用[5]。
　　
　　HBV的基因组位于衣壳内， 为3.2 kb的不完全双链的开环DNA， 基因组共有4个公认的开放读框， 分别为编码包膜蛋白HBsAg的s区， 编码衣壳的核心区(C区， HBcAg)， 编码病毒聚合酶的P区， 以及编码X抗原(HBxAg)的X区。克隆HBSAg基因， 将其转入酵母中表达， 表达产物进行加工处理即成为目前广泛使用的基因工程疫苗[6]。而最早的戊型肝炎病毒重组研究是用大肠杆菌表达的。1992年Purdy等[7]将缅甸株HEV ORF2的3′端大约三分之二基因片段插入pATH10， 在大肠杆菌中表达融合蛋白trpEC2。经Werstern blot分析证明， trpEC2具有很好的抗原性和广泛性。但目前即可以抗乙肝又可以抗戊肝的疫苗尚没有研究。为此本课题组展开此项研究， 将HBV/HEV的融合基因SE， 克隆入融和表达载体pTΩTE中， 转化大肠杆菌BL21， 以期表达出融合蛋白。为进一步研究其免疫保护效果及制备抗乙肝和戊肝的双价DNA疫苗奠定了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 T载体pTA2（从鼎国公司购买）; pTΩTEE质粒（由厦门大学提供）; 大肠杆菌DH5α及BL21（DE3）; pADR1质粒由由南京军区军事医学研究所朱进博士惠赠。乙肝和戊肝患者阳性血清及阴性对照血清来自于吉林省长春市肝胆病医院， 辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG购自Sigma公司。TaKaRa Ex Taq酶， T4 DNA连接酶， EcoR I酶， Xho I酶， Nde I酶（从宝生物公司购买）; 胰蛋白胨， 酵母提取物， IPTG， 甘油， DTT， Bis， Acr， Aps， 琼脂糖， 琼脂， 低Mr标准蛋白: marker DL 15 000; λDNA/EcoR I和Hind III; TEMED， 硝酸纤维素膜， Tris等（从鼎国公司购买）; 蛋白转印PVDF膜（购自Millipore公司）; Western blot化学发光检测试剂盒（SuperSignal West Pico Trail Kit）（购自Pierce公司）; Xray底片（购自Kodak公司）; DYCZ24D双垂直电泳槽（北京六一仪器厂）; VE186转移电泳槽（上海天能科技有限公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 目的基因的获取 PCR扩增乙型肝炎adr亚型的S基因[8]。上游引物F1: 5′CGGAATTCATGGAGAACACAAC3′（GAATTC为EcoR I酶切位点）。下游引物F2: 5′CGCTCGAGTCAAATGTATACC3′（CTCGAG为Xho I酶切位点， 去除终止密码子）。由于上下游引物之间存在引物二聚体， 所以在PCR反应体系中， 先加上游引物， 设计程序为95℃， 4 min。95℃， 30 s; 57℃， 45 s; 72℃， 50 s， 循环10次， 72℃， 10 min。而后再加下游引物， 再进行95℃， 4 min。95℃， 30 s; 57℃， 45 s; 72℃， 50 s， 循环25次， 72℃， 10 min。戊型肝炎ChinaD（GenBank No: D11092.1）亚型的基因序列， 以质粒pTΩTEE为模板进行ORF2编码区的羧基末端中的414～606 aa的基因片段的PCR扩增。上游引物P1: 5′CCATATGACATCTGTAGAGAATGCTCAG3′（CATATG为Nde I酶切位点， 去除启始密码子）下游引物P2: 5′GAATTCGCGCGGAGGGGGGGC3′（GAATTC为EcoR I酶切位点， 去除终止密码子）。PCR反应的设计程序为95℃， 4 min; 94℃， 30 s; 68℃， 50 s; 72℃， 50 s， 循环35次， 72℃， 5 min。分别取PCR回收产物与pTA2载体连接， 命名为pTA2S、 pTA2E， 转化后挑取阳性克隆进行PCR及酶切鉴定并测序。

　　1.2.2 pTΩT7SE重组质粒的构建 分别回收由EcoR I/Xho I双酶切pTA2S和EcoR I/Nde I双酶切pTA2E的目的片段， 各取5 μL与pTΩTE原核表达载体质粒用限制性内切酶Xho I和Nde I消化后回收的产物进行连接。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。PCR鉴定pTΩT7SE重组质粒。

　　1.2.3 pTΩT7SE重组质粒的Southern blot鉴定 为了进一步鉴定pTΩT7SE构建正确， 以其作为模板， 用随机引物法标记的pADR1质粒上的S基因的PCR产物和pTΩTEE为模板进行ORF2编码区的羧基末端中的414～606 aa的基因片段的PCR产物做探针， 采用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit II(ROCHE)进行Southern blot检测。

　　1.2.4 融合蛋白的原核表达 将鉴定正确的重组质粒pTΩT7SE转化表达菌BL21(DE3)， 过夜培养， 挑取单克隆在LB培养基(含有80 mg/L的卡那霉素， 15 g/L的葡萄糖)中37℃， 240 r/min振荡培养过夜。再按1∶50 转接到新的含有氨苄青霉素的LB 培养基中， 37℃震荡培养至A600为0.4 时， 加入终浓度为1 mmol/L IPTG进行诱导表达， 18℃培养20 h。在4℃以6 000 r/min离心10 min， 收集菌体， 冻于-20℃保存待用。为了提高对目的蛋白的检测效率， 在SDS上样缓冲液中加入终浓度为8 mol/L的尿素， 以增加对包涵体的溶解能力。进行（浓缩胶40 g/L， 分离胶120 g/L）SDSPAGE凝胶电泳， 光密度扫描检测目的蛋白相对含量和大小。

　　1.2.5 融合蛋白的Western blot检测 取适量纯化的表达的重组蛋白进行SDSPAGE电泳， 电泳完毕后， 进行转膜， 设置电压30 V， 电流50 mA， 电转3 h后， 将膜取出， 置于封闭液中（含有100 mL/L小牛血清的PBS pH7.4）， 4℃过夜， 用0.5 mL/L 的PBST洗涤3次， 每次10 min， 将用同样方法转的两张膜分别与1∶1 000稀释的乙肝和戊肝病人血清为一抗共同孵育1 h， 同前洗涤， 将膜与1∶10 000兔抗人HRP酶标二抗共同孵育1 h， 同前洗涤后， 膜用吸水纸吸干， 置于干净器皿中， 将SuperSignal West Pico Trail Kit (Pierce)中的发光底物取出， 分别吸取0.5 mL的A液和B液， 混匀加到PVDF膜上， 作用3～5 min， 小心置于暗盒中， 在暗室中安全灯下， 打开底片暗盒， 将Xray底片置于膜上， 曝光时间为10 s， 之后将曝光好的Xray底片置于显影液中， 显影1～3 min， 然后用清水洗净后， 再放入定影液中3 min， 拍照记录结果。

　　2 结果

　　2.1 目的基因的获得 采用PCR方法分别对乙型肝炎和戊型肝炎相关基因进行扩增， 并与pTA2载体连接， 得到连接产物pTA2S、 pTA2E。pTA2S质粒用EcoR I/Xho I酶切鉴定， 得到693 bp的片段， 其大小与GenBank提供的乙型肝炎adr亚型的相应区域大小一致。pTA2E质粒用Nde I/EcoR I酶切鉴定， 得到591 bp的片段， 其大小与GenBank提供的戊型肝炎ChinaD亚型的基因的相应区域大小一致(图1）。分别对其进行测序， 经序列比对， 表明目的基因得到了正确的克隆。

　　图1 pTA2E和pTA2S 的双酶切鉴定（略）

　　1: pTA2E 的EcoR I/Nde I酶切产物; 2: DNA marker λDNA/EcoR I和Hind III; 3: pTA2S的EcoR I/Xho I酶切产物; 4: 质粒pTA2E; 5: 质粒pTA2S.

　　2.2 pTΩT7SE原核表达重组质粒的鉴定 以戊型肝炎病毒部分ORF2基因的上游引物P1和乙型肝炎病毒S基因的下游引物F2对pTΩT7SE表达载体进行PCR扩增得到1 284 bp的产物（图2）， PCR鉴定结果说明乙型肝炎adr亚型的S基因和戊型肝炎ChinaD亚型的ORF2的部分基因序列已经正确连接到pTΩTE表达载体上， pTΩT7SE表达载体的构建已经完成。

　　图2 pTΩT7SE载体的PCR鉴定（略）

　　1: DNA marker(DL 15 000); 2， 3: 以戊型肝炎病毒部分ORF2基因的上游引物和乙型肝炎病毒S基因的下游引物进行PCR扩增得到的产物.

　　2.3 pTΩT7SE重组质粒的Southern blot鉴定 以pTΩT7SE作为模板， pADR1质粒上的S基因的PCR产物和pTΩTEE为模板进行ORF2编码区的羧基末端中的414～606 aa的基因片段的PCR产物做探针， 进行Southern blot检测， 均有阳性信号， 进一步说明重组质粒pTΩT7SE构建成功(图3)。

　　图3 质粒pTΩT7SE的Southern blot结果（略）

　　1: SSouthern blot; 2: ESouthern blot.

　　2.4 pTΩT7SE蛋白的原核表达 pTΩT7SE在大肠杆菌BL21（DE3）中能够在1 mmol/L的IPTG诱导下成功的表达， 光密度扫描检测目的蛋白相对含量为30.52%。由于EcoR I， Xho I酶切位点和尾部HIS标签的存在， 使得表达的目的蛋白质的Mr在50 000左右。这说明利用BL21（DE3）进行HBV/HEV融合基因的表达是可行的（图4）。

　　图4 质粒pTΩT7SE在大肠杆菌BL21（DE3）的表达（略）

　　1: 蛋白marker; 2: BL21（DE3）的总蛋白; 3: IPTG诱导后的pTΩT7SE的表达; 4: IPTG诱导后的pTΩT7的表达.

　　2.5 重组蛋白的Western blot分析 Western blot表明， 纯化的重组蛋白能分别和乙肝和戊肝两种病毒的阳性血清特异识别， 而空载体对照菌样品无反应（图5）。

　　图5 纯化的重组蛋白Western blot检测（略）

　　1: 对照; 2: 纯化的HBV重组蛋白; 3: 纯化的HEV重组蛋白.

　　3 讨论
　　
　　由于HBV的保护性抗原表位主要集中于编码包膜蛋白HBsAg的s区， 所以目前所用的乙肝基因工程疫苗都由HBsAg组成。而戊型肝炎病毒(HEV)能引起中和抗体的重要表位位于ORF2和ORF3的羧基末端， 但ORF3编码区在不同株系中变异较大， 因此HEV重组蛋白疫苗研究主要针对ORF2编码蛋白[6]。故本研究以pTΩTEE和pADR1质粒为模板， 通过设计特异性引物PCR扩增获得乙型肝炎的S抗原基因和HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414～606 aa的基因片段， 成功构建了融合基因的大肠杆菌表达载体pTΩT7SE。质粒pTΩT7SE能够在1 mmol/L的IPTG诱导下表达， 目的蛋白相对含量为30.52%。Mr在50 000左右。
　　
　　在大肠杆菌中表达的外源蛋白有非融合型和融合型蛋白两种， pQE30表达载体属T5启动子转录转译系统， 是一种非融合型蛋白的表达载体; pET载体系列的启动子是T7 DNA 聚合酶启动子， 它主要表达可溶性的融合蛋白。本研究采用的pTΩTE原核表达载体是由厦门大学用质粒pET11a和pBPFΩ7以及pET24(+)经过重组得到的， 它同时克服了pET11a只含有BamH I一个多克隆位点和pET24(+)只是一个转录载体的缺陷， 同时引入了Ω增强子序列， 可以使表达效率进一步提高。质粒pTΩTE具有能自主复制的复制子， 松弛型， 质粒高拷贝数， 便于质粒大量制备及表达; 强启动子、强转录终止子， 便于高水平转录， 防止转录通读; 可诱导性， 尤其在高表达对细胞有毒性的蛋白; 合适的核糖体结合位点， 提高翻译起始效率和翻译水平; 具有多个单一酶切位点的多克隆位点， 便于外源基因插入及筛选; 分子量小， 便于较大外源基因的插入; 具有抗药性标志， 有利于插入外源基因克隆的筛选， 安全， 不污染环境， 对人无害[9]。
　　
　　携带有的pTΩT7SE表达载体的大肠杆菌在含有相应诱导物和抗菌素的条件下培养， 可以表达二价抗原， 这比加同样诱导物的含有pTΩTE表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）和单纯的大肠杆菌BL21（DE3）在SDSPAGE凝胶上要多出一条明显的条带[10]。Western blot结果表明表达的蛋白具有很好的特异性。所以用重组的pTΩT7SE原核表达载体进行HBV/HEV二价疫苗的研制， 具有潜在的经济和社会效益。为肝炎的治疗提供一个新的方法。

参考文献

　　[1] Beasley RP. Hepatitis B virus: the major etiology of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer， 1988， 61(10): 1942-1956.

　　[2] Lau JY， Wright TL. Molecular Virology and pathogenesis of hepatitis B[J]. Lancet， 1993， 342(8883): 1335-1340.

　　[3] Malik AH， Lee WM. Hepatitis B therapy: the plot thickens[J]. Hepatology， 2000， 30(2): 579-581.

　　[4] Kao JH， Chen DS. Global control of hepatitis B virus infection[J]. Lancet Infect Dis， 2002， 2: 395-403.

　　[5] 赵丹燕. 戊型肝炎重叠乙型肝炎感染的研究[J]. 医学研究杂志， 2006， 2: 40-42.

　　[6] 成 军， 杨守纯. 现代肝炎病毒分子生物学[M]. 北京: 人民军医出版社， 1997: 179-182.

　　[7] Purdy MA， McCaustland KA， Krawczynski K， et al. Expression of HEV trep E fusion protein containing epitopes recognized by antibodies in sera from human cases and experimentally infected primates[J]. Arch Virol， 1992， 123: 335-349.

　　[8] 吴祥甫， 周翊钟， 冯宗铭， 等. 人乙型肝炎病毒HBV adr亚型基因组的克隆和限制酶切图谱[J]. 中国科学B辑， 1983， 2: 162-167.

　　[9] Brinkmann U， Mattes RE， Buckel P. Optimizing the expression in E.coli of a synthetic gene[J]. Gene， 1989， 85: 109.

　　[10] 陆 海， 吴 薇， 曾庆银， 等. 大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白的研究[J]. 北京林业大学学报， 2001， 23(6): 124.