弓形虫多表位DNA疫苗的构建及其免疫保护作用

【摘要】 目的: 构建弓形虫多表位DNA疫苗并研究其免疫保护效果。方法: 将编码含弓形虫多个T、 B细胞表位的6段弓形虫多肽基因， 以5个甘氨酸编码基因相间隔相连接， 克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(＋)中， 构建成多表位弓形虫DNA疫苗。免疫BALB/c小鼠， 测定其诱导的特异性抗体水平及T淋巴细胞增殖状况， 同时进行弓形虫攻击感染保护实验。结果: 成功构建了包含多个弓形虫表位的真核表达质粒pcDNA3.1/TME， 以其作为DNA疫苗免疫小鼠， 可诱导机体产生弓形虫特异性的体液及细胞免疫应答， 产生有效的抗弓形虫保护性免疫应答。结论: 构建的弓形虫多表位DNA疫苗能诱导机体产生有效的保护性免疫应答， 在控制弓形虫感染上具有可行性。

【关键词】 弓形虫 表位 DNA疫苗

　　刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种人兽共患寄生虫病， 广泛流行于我国及世界各地， 全球感染率高达25%～35%， 我国人群感染率为5%～20%。成人感染弓形虫后多呈无症状带虫者， 孕妇感染后可造成流产、 胎儿畸形以及胎儿死亡等不良妊娠结局， 免疫功能受抑制或有免疫缺陷的患者合并弓形虫感染时， 可成为患者死亡的主要原因之一［1， 2］。近年来， 国内外学者在弓形虫疫苗的研究上进行了大量的探索工作， 大致经历了全虫疫苗、 虫体特异组分疫苗和核酸疫苗等阶段， 但均尚未研制出安全有效疫苗。动物实验发现， 弓形虫全虫疫苗、 特异抗原组分疫苗有预防弓形虫感染或降低感染程度作用， 但前者可能会引起再感染， 后者的免疫保护效果较差［3-5］。弓形虫病核酸疫苗有望弥补上述疫苗存在的不足， 具有良好的开发应用前景， 但目前研究尚处于初始阶段， 而且对弓形虫多表位DNA疫苗的研究尚缺乏报道。本研究中我们将编码含弓形虫多个T、 B细胞表位的6段弓形虫多肽基因（分别编码SGA1 238～256aa、 SGA1 281～320aa、 GRA1 170～193aa、 GRA4 331～345aa、 GRA4 229～245aa和GRA2 171～185aa）， 以5个甘氨酸编码基因相间隔进行连接， 克隆入真核表达质粒pcDNA3.1中， 构建成多表位弓形虫DNA疫苗， 以期获得更好的免疫保护效果， 为构建安全有效的多表位弓形虫DNA疫苗提供理论和实践基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 质粒pcDNA3.1(+)、 大肠杆菌DH5α及弓形虫RH国际标准株均为本室保存。核酸内切酶EcoR I、 BamH I， T4连接酶购自美国MBI公司。胎牛血清购自天津正江生物公司。兔抗小鼠IgGHRP购自博士德公司。TMB为美国Sigma公司产品。RPMI1640为美国Gibico公司产品。MTT（四甲基偶氮唑盐）为美国Amresco公司产品。96孔细胞培养板购自丹麦Costor公司。BALB/c及ICR小鼠购于西安交通大学实验动物中心。

　　1.2 方法

　　1.2.1 真核表达载体pcDNA3.1/TME的构建 目的基因片段， 包含编码弓形虫SGA1 238～256aa、 SGA1 281～320aa、 GRA1 170～193aa、 GRA4 331～345aa、 GRA4 229～245aa和GRA2 171～185aa 6个多肽片段的基因（GenBank S76248， M26007， M76432， L01753）， 每片段间以5个甘氨酸编码基因相间隔进行连接， 并在5'端添加了BamH I酶切位点和ATG启动密码子， 3′端添加了TAA终止密码子和EcoR I酶切位点， 共483 bp， 由上海生工生物工程技术有限公司合成。按常规方法将该目的基因插入真核表达质粒pcDNA3.1(+) BamH I和EcoR I酶切位点之间， 转化大肠杆菌DH5α， 重组质粒经DNA测序鉴定无误后， 命名为pcDNA3.1/TME。

　　1.2.2 质粒的大剂量提取及纯化 碱裂解法分别大剂量提取重组质粒pcDNA3.1/TME和空质粒pcDNA3.1， 并用聚乙二醇沉淀法纯化后， 经紫外分光光度计定量， 溶于灭菌去离子水中， 浓度均为1 g/L。

　　1.2.3 动物免疫 SPF级雌性6周龄BALB/c小鼠32只， 随机分为两组， 即注射pcDNA3.1空质粒的对照组和注射重组质粒pcDNA3.1/TME的实验组， 每组16只。每只小鼠均先用2.5 mL/L盐酸布比卡因50 μL分别注射小鼠双侧胫前肌进行预处理， 3 d后在小鼠双侧胫前肌相同部位各注射50 μL（50 μg）质粒， 每只小鼠每次免疫的质粒总量为100 μg。3周后以相同方法和剂量加强免疫1次。

　　1.2.4 弓形虫速殖子培养裂解物（TLA）的制备 液氮冻存的弓形虫RH强毒株冻存管投入37℃水浴中复苏后， 抽取0.1 mL腹腔注射ICR小鼠， 待小鼠出现发病症状（如竖毛、 不食、 肛门拖粪、 呼吸困难等）后， 用3 mL生理盐水冲洗小鼠腹腔， 抽取的腹腔液腹腔注射0.1 mL给其他ICR小鼠进行传代， 每隔3 d 传代1次。多次传代获得的小鼠腹腔生理盐水冲洗液混合后， 先经8 000 g离心， 用PBS洗涤沉淀1次， 再将沉淀重悬于PBS， 反复冻融10次后， 10 000 g离心5 min， 上清经0.22 μm无菌滤器过滤后， 即为弓形虫速殖子裂解物（TLA）。并分别测定其A260和A280值， 计算样品浓度=(1.55×A280值-0.77×A260值)×稀释倍数。

　　1.2.5 免疫小鼠特异性抗体的测定 加强免疫后第10天， 两组小鼠各取6只， 眼眶取血分离血清， 间接ELISA法测定弓形虫特异性IgG。用TLA包被96孔酶标板4℃过夜， 用含50 mL/L胎牛血清的PBS 37℃封闭2 h。待测血清先经1∶20倍稀释后， 再倍比稀释后加入96孔板中， 37℃孵育1 h后， 以兔抗小鼠IgGHRP（1∶2 000）作为酶标二抗孵育1 h后， h3O2TMB底物显色15 min， 以2 mol/L硫酸4终止反应， 用酶标仪于450 nm A值。阳性判定标准: 实验组A450均值/对照组A450均值&>2.1为阳性。

　　1.2.6 免疫小鼠抗原特异性淋巴细胞增殖实验 上步操作中的小鼠， 眼眶取血后脱颈椎处死， 无菌操作取脾脏， 200目钢网使其分散成脾细胞悬液， 淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞， PBS洗涤2次后， 用完全RPMI1640培养液配成1×109/L的脾淋巴细胞悬液。将脾淋巴细胞悬液加入96孔培养板中， 每孔1×105个细胞， 每个样本设复孔6个， 其中3孔加入终浓度10 mg/L TLA为实验孔， 另3孔做为空白对照孔， 在37℃ 50 mL/L CO2条件下孵育72 h后， 加入终浓度5 g/L的MTT继续培养4 h。测定时离心去上清， 每孔加入100 μL酸性异丙醇， 振荡5 min， 使甲臢完全溶解后， 用酶标仪于570 nm测定A值。按以下公式测定各样本的刺激指数（SI)＝实验孔A570均值/对照孔A570均值。

　　1.2.7 免疫小鼠抗弓形虫攻击感染实验 加强免疫后第10天， 实验组及对照组小鼠(n=10)均用经ICR小鼠腹腔传代的弓形虫RH株速殖子进行感染攻击， 每只小鼠腹腔注射1×104个弓形虫RH株速殖子， 观察两组小鼠的存活时间。

　　1.2.8 统计学处理 实验数据分析采用双尾t检验， P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒pcDNA3.1/TME的鉴定 将获得的重组质粒经BamH I、 EcoR I双酶切电泳分析和DNA测序鉴定， 结果证明构建的重组质粒pcDNA3.1/TME读码框架正确。

　　2.2 免疫小鼠弓形虫特异性抗体测定结果 pcDNA3.1/TME免疫可诱导小鼠产生针对弓形虫抗原的特异性抗体， 其特异性IgG抗体平均效价为1∶160（图1）。

　　图1 ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体结果（略）

　　Fig 1 The IgG titers determined by ELISA in the sera of mice immunized with pcDNA3.1/TME and pcDNA3.1

　　bP&<0.01 vs control group.

　　2.3 免疫小鼠抗原特异性淋巴细胞增殖实验 pcDNA3.1/TME免疫组小鼠抗原特异性淋巴细胞增殖SI值较pcDNA3.1空质粒对照组SI值显著增高 （1.8±0.2 vs 1.1±0.1， P&<0.01）， 表明pcDNA3.1/TME免疫可诱导弓形虫抗原特异性T淋巴细胞的显著增殖。

　　2.4 弓形虫RH株速殖子攻击感染后免疫小鼠生存时间 两组小鼠均未能耐受弓形虫RH株速殖子腹腔攻击感染， 但pcDNA3.1/TME免疫小鼠生存时间(180±17）h较以空质粒pcDNA3.1免疫小鼠（115±8）h显著延长（P&<0.05）， 证明真核表达质粒pcDNA3.1/TME作为DNA疫苗进行免疫能诱导机体产生一定的针对弓形虫感染的保护性免疫应答。

　　3 讨论
　　
　　多表位DNA疫苗除了可同时激活细胞和体液免疫之外， 还具有诸多优点［6］: (1)内源性表位提呈可避免表位肽的降解; (2)可去除抗原中非相关的和免疫抑制性区域， 降低免疫耐受和自身免疫发生的可能性， 同时可去除潜在的致病区域， 提高疫苗的安全性。(3)可使免疫效应集中在高度保守的特异性表位， 防止抗原调变导致免疫逃逸; (4)在单一载体中易于容纳多个不同抗原、 不同MHC类限制性表位， 使疫苗可针对多种病原体或不同HLA型别的人群， 更具有广谱性。因此多表位疫苗是目前DNA疫苗研究的重点之一。本实验中我们即把含多个T、 B细胞表位的6段弓形虫多肽基因克隆入真核表达质粒pcDNA3.1中， 构建成抗弓形虫多表位DNA疫苗。实验结果表明以该多表位DNA疫苗免疫BALB/c小鼠， 可诱导其产生特异性的体液和细胞免疫应答。同时与pcDNA3.1空质粒免疫的BALB/c小鼠比较， pcDNA3.1/TME免疫小鼠对致死剂量弓形虫RH株速殖子的感染攻击具有更强的抵抗作用， 免疫小鼠存活期显著延长， 证明该抗弓形虫多表位DNA疫苗能诱导机体产生有效的保护性免疫应答。
　　
　　虽然细胞免疫一直被认为是机体抵抗弓形虫感染的主要机制， 但体液免疫在抗弓形虫感染， 特别是在弓形虫感染3～4周后起着重要作用［7］， 因此本研究中设计的抗弓形虫多表位DNA疫苗除了含有多个T细胞表位外， 也含有多个B细胞表位［8-10］， 以期可以获得较全面的保护作用。鉴于B细胞表位的存在， 本研究中构建的多表位DNA疫苗的各抗原肽基因以编码5聚甘氨酸的DNA片段加以间隔， 即以该柔性5聚甘氨酸做为间隔肽， 使各弓形虫抗原肽尽量保持其原有空间构型， 从而不影响机体免疫系统对各B细胞表位的识别。实验结果表明以该方法构建的DNA疫苗确可诱导特异性的抗弓形虫抗体。
　　
　　本研究接受RH株弓形虫速殖子感染攻击的pcDNA3.1/TME免疫小鼠虽然存活时间有了很大的延长， 但最终均未能存活， 其主要原因可能是本实验中弓形虫速殖子的攻击量(1×104/鼠)较高， 疫苗诱导的机体免疫应答不能完全清除感染的速殖子。如果攻击感染采用口服包囊或卵囊模仿自然感染途径， 或采用优化合理的低剂量速殖子攻击， 可能更有助于对疫苗免疫保护效果的测定。此外， 本研究中以pcDNA3.1/TME免疫小鼠的弓形虫特异性淋巴细胞增殖倍数及抗体效价均不高， 这一方面与实验中采用的测定抗原为TLA， 而非相应的纯抗原肽有关; 另一方面也与DNA疫苗本身免疫效果不理想有关。目前国内外DNA疫苗研究的一个重要方向即为如何提高其免疫效果， 我们也将在后续的研究工作中对如何提高pcDNA3.1/TME的免疫效果进行研究。
　　
　　本研究我们通过对免疫小鼠特异性抗体测定、 抗原特异性T淋巴细胞增殖实验和弓形虫攻击感染保护实验， 证明抗弓形虫多表位DNA疫苗能诱导机体产生弓形虫特异性的体液及细胞免疫应答， 诱导机体产生有效的抗弓形虫保护性免疫应答， 表明多表位DNA疫苗在控制弓形虫感染上具有可行性， 为构建安全有效的多表位弓形虫DNA疫苗提供理论和实践基础。

参考文献

　　［1］ 石 琦， 郝炳华， 周玉玲， 等. 小鼠淋巴细胞体外抗弓形虫作用的实验研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2003， 19(5): 493-495.

　　［2］ Montoya JG， Liesenfeld O. Toxoplasmosis［J］. Lancet， 2004， 363(9425): 1965-1976.

　　［3］ Innes EA， Vermeulen AN. Vaccination as a control strategy against the coccidial parasites eimeria， toxoplasma and neospora［J］. Parasitology， 2006， 133(Suppl): S145-168.

　　［4］ Angus CW， KlivingtonEvans D， Dubey JP， et al. Immunization with a DNA plasmid encoding the SAG1 (P30) protein of Toxoplasma gondii is immunogenic and protective in rodents［J］. J Infect Dis， 2000， 181(1): 317-324.

　　［5］ Alberto F， Alexandro R， Sergio O， et al. Protective effect of a nake DNA vaccine cocktail against lethal toxoplasmosis in mice［J］. Vaccine， 2003， 21(13-14): 1327-1335.

　　［6］ 史 霖， 袁育康， 胜 利， 等. 多CTL表位DNA疫苗诱导特异性CTL应答的研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(4): 430-432.

　　［7］ Kang H， Remington JS， Suzuki Y. Decreased resistance of B cell deficient mice to infection with Toxoplasma gondii despite unimpaired expression IFNγ， TNFα and inducible nitric oxide synthase［J］. J Immunol， 2000， 164(5): 2629-2634.

　　［8］ Alix AJP. Predictive estimation of protein linear epitopes by using the program PEOPLE［J］. Vaccine， 2000， 18(3-4): 311-314.

　　［9］ Siachoque H， Guzman F， Burgos J， et al. Toxoplasma gondii: Immunogenicity and protection by P30 peptides in a murine model［J］. Exp Parasitol， 2006， 114(1): 62-65.

　　［10］ Beghetto E， Pucci A， Minenkova O， et al. Identification of a human immunodominant Bcell epitope within the GRA1 antigen of Toxoplasma gondii by phage display of cDNA libraries［J］. Inter J Parasitol， 2001， 31(14): 1659-1668.