人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的构建和表达

　　　　 作者：刘荣， 姜文国， 刘芳， 张砚君， 范冬梅， 杨铭， 熊冬生， 杨纯正

【摘要】 　　目的: 构建和表达人41BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白， 并测定该融合蛋白的生物学活性。方法: 采用PCR和ovelap PCR方法构建人41BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白， 并用双脱氧终止法测定DNA序列; 采用亲和层析法纯化该产物， 并用150 g/L SDSPAGE 和Western blot鉴定纯化产物; 采用FACS法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果: DNA序列测定结果表明: 人41BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白已构建成功， 表达可溶性产物的产量达4 mg/L以上， 具有与 Raji细胞(CD20+)和A549（41BB＋）细胞结合的活性。结论: 利用融合蛋白形式， 首次成功地构建了人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白， 并获得较高表达。表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。

【关键词】 4 1BBL CD20 融合蛋白 免疫治疗

　　［Abstract］ AIM: To construct and express human 41BBL/antiCD20 bispecific fusion protein and identify its biological activity. METHODS: PCR and overlapping PCR were used to construct human 41BBL/antiCD20 bispecific fusion protein. DNA sequencing was performed by the terminus of the fusion protein nucleotide.The product was purified by affinity chromatography and analyzed　　by Western blot and its antigenbinding activity was examined by FACS. RESULTS: The data of DNA sequence showed that human 41BBL/antiCD20 bispecific fusion protein was correct. The fusion protein was recovered in high yield (up to 4 mg/L) after Etag purification and predominantly(90％) as a dimer. The fusion protein could bind to Raji cells(CD20＋) and A549 cells(41BB＋)， respectively. CONCLUSION: The human 41BBL/antiCD20 bispecific fusion protein with high level expression was successfully obtained and could bind to Raji ceIls and A549 cells.

　　［Keywords］41BBL; CD20; fusion frotein; immunotherapy

　　长期以来肿瘤的临床治疗一直受到三大难题的困扰: (1)常规的放、 化疗方案选择性较差; (2)肿瘤细胞产生耐药性; (3)肿瘤发生微小转移。双功能抗体或融合蛋白因其具有同时与肿瘤相关抗原和免疫效应细胞表面分子标记结合， 并能有效地使效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞的作用而倍受关注， 最有希望成为解决这些问题的一条新途径。
　　
　　CD20主要表达在前B细胞和成熟B细胞及95%以上的NHL淋巴瘤细胞， 是可以用来作为肿瘤定向免疫治疗的抗原。近来研究的41BB/41BBL信号途径的协同刺激在许多模型系统显示了抗肿瘤效应， 同时应用41BBL和CD3单克隆抗体（mAb）可代替专职抗原提呈细胞的刺激能力， 然而全身性的T细胞激活将导致不需要的临床副作用， 所以CD3/41BB信号必须严格定位在肿瘤位点。为了特异性定向肿瘤细胞和激活肿瘤特异性T细胞， 抗肿瘤免疫性能够被诱导和恢复， 利用双特异抗体针对肿瘤相关抗原与效应细胞相连， 共同作用于肿瘤细胞， 实现肿瘤的靶向治疗［1-3］， 我们已成功构建了抗CD3/抗CD20的diabody表达载体［2］和人41BBL胞外区基因表达载体pAYZ41BBL［4］并证实前者有明显的抑制肿瘤生长的活性而后者则能明显抑制激活的T细胞系凋亡， 在此基础上我们构建了人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白表达载体并研究其生物活性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 E.coli 16C9.Raji和A549细胞系由本室保存， 培养在含100 mL/L小牛血清（天津血液病研究所科技开发公司）的RPMI1640（GibcoBRL）， 表达载体pAYZ41BBL和pAYZFCD20由本室构建保存， Taq DNA聚合酶、 Pfu DNA聚合酶购自上海申博生物公司， 限制性内切酶Mlu I， Nhe I， Sph I 均购自大连宝生物公司， T4 DNA连接酶购自Invitrogen公司，　　 鼠抗Etag抗体， HRP标记的鼠抗Etag抗体及抗Etag亲和层析柱均购自Pharmacia公司， 其他均为国产分析纯生化试剂。 PCR引物: P1 5′CGC ATT TCT TCT TGC ATC TA3′，　　P2 5′GCG GAG AGA GCC ACC TCC GCC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT C3′， P3 5′GGC GGA GGT GGC TCT CTC CGC GAG GGT CCC GAG C3′， P4 5′GCGC GCTAGC TTA TTC CGA CCT CGG TGA AGG GAG3′ (Nhe I)， P5 5′GCGC GCTAGC ACG TAA AAA GGG TAT CTA GAG3′ (Nhe I)， P6 5′GCG GAG AGA GCC ACC TCC GCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GA3′， P7 5′GAT AAG CTG TCA AAC ATG AG3′。下画线为括号内的限制性内切酶位点。

　　1．2 方法

　　1．2．1 DNA的酶切、 连接、 转化等常规分子生物学操作 参照文献［5］进行。

　　1．2．2 人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白表达载体的构建 利用PCR法从抗CD20(Fab’)2和人41BBL胞外区表达载体上分别采用P1、 P2， P3、 P4， P5、 P6， P3、 P7扩增CD20VL， CD20VH， 41BBL胞外区， 41BBL胞外区Etag基因， 经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后， 利用overlap PCR， 以G4S作为连接肽， 分别将CD20VL与41BBL胞外区， CD20VH与41BBL胞外区Etag连接形成DNA片段CD20VL41BBL胞外区、 CD3VH41BBL胞外区Etag。经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后， DNA片段CD20VL41BBL胞外区用Mlu I+Nhe I消化， DNA片段CD3VH41BBL胞外区Etag用Nhe I+Sph I消化， 并与经Mlu I+Sph I消化的表达载体pAYZ连接， 形成人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白表达载体pAYZDBC。

　　1．2．3 人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的高效表达 将载体pAYZDBC转化E.coli 16C9， 挑取单菌落接种于含氨苄青霉素(0.1 g/L)的2YT培养基（16 g/L胰蛋白胨， 10 g/L酵母提取物， 5 g/L NaCl）中， 37℃振荡培养8 h后， 按1∶2的比例转接于含氨苄青霉素(0.1 g/L )的Ap5培养基（1.5 g/L葡萄糖， 11 g/L酸水解酪蛋白， 0.6 g/L酵母提取物， 0.19 g/L MgSO4， 1.07 g/L NH4Cl， 3.73 g/L KCl， 1.2 g/L NaCl， 0.12 mol/L三乙醇胺 pH7.4）中， 25℃振荡培养24 h， 4℃离心收集菌体， 将菌体于-20℃冻存1 h后， 化冻后加入细菌周质腔提取液（三羟甲基氨基甲烷25 mmol/L， 乙二胺四乙酸1 mmol/L， 苯甲基磺酰氟（PMSF）0.1 mmol/L， 蔗糖200 g/L （W/V）， NaCl 200 mmol/L， pH7.5）， 于4℃轻摇1 h， 12 000 r/min， 4℃离心10 min， 收集上清为表达产物的粗提物。

　　1．2．4 人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的纯化 应用抗Etag亲和层析柱纯化人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白。用Binding Buffer （10 mmol/L MES， 1 mmol/L EDTA）（pH7.0）平衡和Elution Buffer（0.1 mmol/L 甘氨酸）（pH3.0）洗脱， FPLC收集洗脱峰。150 g/L SDSPAGE及Western blot对纯化后的蛋白进行分析。

　　1．2．5 人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白与Raji细胞及A549细胞结合活性的测定 应用活细胞间接免疫荧光法(FACS)。

　　2 结果

　　2．1 人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白表达载体的构建 CD20VL基因羧基端与41BBL胞外区基因的氨基端通过短肽G4S相连。CD20VH基因的羧基端与41BBL胞外区Etag基因的氨基端也通过相同的短肽连接（图1）， 并经与表达载体pAYZ连接， 构建成带有纯化标记Etag短肽表达载体pAYZDBC（图2）， 经序列测定其核苷酸序列与原始序列相同。该表达载体在低磷酸盐的培养条件下， 由启动子phoA诱导合成带双顺反子的mRNA， 并在该mRNA的2个含有SD序列的位置合成相应的多肽链， 在引导肽stII的作用下分泌到细菌周质腔， 形成融合蛋白。

　　图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳（略）

　　Fig 1 Analysis of PCR and restriction digestion products by agarose gel electrophoresis

　　A: 1: DNA marker(DL 2 000); 2: CD20VL; 3: 41BBL; 4: CD20VH; 5: 41BBLEtag. B: 1: DNA marker(DL 2 000); 2: CD20VL41BBL; 3: CD20VH41BBLEtag.

　　图2 人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白表达载体pAYZDBC的构建（略）

　　Fig 2 Construction of plasmid pAYZDBC

　　2．2 人41BBL胞外区/抗CD20 融合蛋白的表达和纯化 用人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白表达载体pAYZDBC转化E.coli 16C9， 经低磷酸盐诱导表达， 在信号肽的引导下， 表达产物分泌进入细菌外周质腔。应用高渗溶液提取细菌外周质腔表达产物， 并用抗Etag亲层析柱纯化。纯化产物的产量约为4 mg/L。纯化的蛋白经150 g/L的SDSPAGE分析， 在Mr 33 000和31 000各有一条蛋白带， Western blot结果表明， 抗Etag抗体只能与有Etag片段的Mr为33 000的蛋白带杂交， 而与Mr为31 000的蛋白带无特异性反应， 与预期的结果相符（图 3）。

　　2．3 人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白与Raji细胞及A549细胞结合活性的测定 间接免疫荧光结合实验测定结果显示， 人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白能与Raji细胞及 A549细胞结合活性(图4)， 表明人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白保留了与靶抗原的特异性结合能力。

　　图3 SDSPAGE(A)和Western blot(B)分析41BBL/antiCD20 融合蛋白表达与纯化结果（略）

　　Fig 3 SDSPAGE(A) and Western blot(B) analysis of the 41BBL/antiCD20 fusion protein

　　M: Protein marker; 1: Periplasmic extract; 2: Purified 41BBL/antiCD20 fusion protein; 3: AntiEtag column flow through; 4: Analyzed 41BBL/antiCD20 fusion by SDSPAGE.

　　图4 FACS分析人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白与Raji细胞及A549细胞结合活性（略）

　　Fig 4 FACS analysis of the 41BBL/antiCD20 fusion protein binding to both CD20positive Raji cells and 41BBpositive A549 cells

　　a: Raji and PBS; b: Raji and the 41BBL/antiCD20 fusion protein; c: A549 and PBS; d: A549 and the 41BBL/antiCD20 fusion protein.

　　3 讨论
　　
　　常规化疗和放疗选择性差、 肿瘤微小残留灶的存在以及肿瘤细胞耐药， 造成治疗失败或者肿瘤复发， 这将是免疫治疗的靶标。已经有许多表达在恶性细胞上的肿瘤相关抗原(tumorassociated antigens， TAA)被证实。并且一些抗TAA的抗体已经从实验室走向了临床。抗TAA的抗体不仅它们本身是靶向治疗药物， 而且还可以作为其他药物和效应细胞的靶向媒介。
　　
　　B淋巴细胞瘤是常见的血液系统疾病， CD20是B淋巴细胞表面膜蛋白， 是目前作为生物治疗B淋巴细胞的主要靶点， 其原因在于: (1)CD20仅在前B淋巴细胞、 未成熟B淋巴细胞、 成熟B淋巴细胞、 激活B淋巴细胞中表达， 而在浆细胞、 淋巴多能干细胞以及其它组织均无CD20的表达。(2)CD20和抗CD20抗体结合后不发生内吞作用， 因此细胞表面CD20的数量并不因为抗CD20抗体的结合而减少。(3)CD20抗原比较暴露， 不为其他蛋白所掩盖。(4)在体内血清中无游离的CD20的存在。1997年美国FDA批准IDEC pharmaceuticals 公司生产的抗CD20抗体Rituxan 应用于B淋巴瘤的临床治疗， 疗效显著， 且毒性较小。由于抗CD20抗体不仅本身是靶向治疗药物， 而且还可以作为其他药物和效应细胞的靶向媒介。为了特异的定向肿瘤细胞， Xiong等［2］已成功构建了抗CD3/抗CD20Diabody， 并进行了体内外生物活性测定， 实验证实抗CD3/抗CD20 Diabody具有明显的抑制肿瘤生长的活性， 有望成为一种新的治疗B细胞恶性肿瘤的方法。
　　
　　人41BBL包含254氨基酸， 是存在于细胞膜表面的Ⅱ型膜蛋白。为了激活初始T细胞， 这需要两个关键的信号: 一个信号通过T细胞受体， 而另一个信号是协同刺激， 研究发现， 41BBL的功能主要在于通过胞外区和41BB结合， 传导信号来发挥协同刺激作用， 动物试验显示增强T细胞介导的抗肿瘤免疫性至为重要， 41BBL能够协同刺激CD28T细胞， 导致细胞分裂， 细胞因子的释放以及增加穿孔素水平和增强细胞毒性效应器功能［6］。同时， 41BB/41BBL是一个协同刺激的放大器， 它能增强CD8+ T 细胞克隆扩增和存活能力， 以及发展一些依赖于细胞因子的效应器功能［7］， 有利于产生肿瘤特异性的具有持续性杀伤活性的CD8+ T细胞。
　　
　　我们研究也发现人41BBL胞外区蛋白能使激活的T细胞系IL2的释放增加， 并且使激活的T细胞系凋亡减少一倍以上［4］。然而人41BBL胞外区蛋白直接临床应用会参与全身激活T细胞的反应， 必然会导致不必要的副作用， 所以这种作用必须严格定位在肿瘤位点［8］。为了特异的定向肿瘤细胞， 本实验我们进一步采用Gly4Ser柔性短肽将41BBL胞外区与抗CD20 VL和CD20 VH分别连接起来， 构建人41BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白表达载体。由于人41BBL和抗CD3抗体分别模拟抗原提呈细胞的双信号系统［9］， 可以代替专职抗原提呈细胞的能力， 我们认为人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白将能改善抗CD3/抗CD20 diabody的肿瘤特异性， 它的相关杀伤活性还在进一步研究中。另外， 通过41BBL/抗肿瘤相关抗原融合蛋白， 不需要经41BBL基因转染恶性肿瘤细胞， 41BBL阴性的肿瘤能够转变为41BBL阳性的肿瘤， 从而增加抗原提呈， 改善肿瘤杀伤， 这为适合临床应用提供了新思路和新途径。

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