小鼠BCMA基因启动子活性研究

【摘要】 目的: 探索B淋巴细胞成熟抗原（BCMA）基因5′上游序列的启动子活性， 为进一步研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据。方法: 构建由BCMA基因5′上游-820～+145、 -607～+145、 -359～+145、 -157～+145、 -93～+145 5个片段驱动的荧光素酶报告载体pGL3B820、 pGL3B607、 pGL3B359、 pGL3B157、 pGL3B93， 通过转染J558L、 293T、 HeLa细胞检测荧光素酶的表达， 观察荧光素酶相对活性。结果: 5种5′删除体的转录激活性由大到小为pGL3B157&>pGL3B607&>pGL3B359&>pGL3B93&>pGL3B820。pGL3B157在3种细胞中的转录激活能力为J558L&>HeLa&>293T， 且在J558L中的转录激活能力明显强于Hela和293T细胞。结论: BCMA基因5′上游序列“-820 bp～+145 bp”具有启动子活性， 核心启动子可能位于-93～+145区域中。

【关键词】 BCMA 启动子 报告基因

　　B淋巴细胞成熟抗原(Bcell maturation antigen， BCMA)为B细胞表面分子， 属于肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)， BCMA由184个氨基酸残基组成， 其胞内部分由80个氨基酸残基构成， BCMA的功能及作用机制迄今尚未阐明［1-3］。BCMA基因剔除小鼠有正常的脾结构， B细胞发育正常， T细胞非依赖性免疫反应和T依赖性免疫反应未见明显异常［4］， 但浆细胞明显减少， 证明BCMA在维持浆细胞的存活中起了重要的作用。迄今对BCMA的研究主要集中于BCMA在B淋巴细胞发育中的作用， 及BCMA蛋白质的功能分析， 而对其自身的表达调控机制知之甚少， BCMA基因5′侧翼区基因组测序尚未完成， BCMA基因翻译起始位点前965 bp 5′侧翼区为未知序列。我们采用报告基因分析的方法， 构建了由BCMA基因5′上游不同长度片段驱动的报告载体， 通过转染不同细胞检测荧光素酶的表达， 初步探索了BCMA基因的5′上游序列启动子活性和BCMA启动子在不同细胞中活性的差异， 为进一步寻找和定位BCMA 5′上游序列内重要的顺式作用元件， 研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 菌株JM109为本室保存， J558L购自上海午立生物有限公司， 293T细胞购自中科院协和医学院细胞中心， HeLa细胞为本室保存。pGL3系列报告基因载体和 pRLTK表达质粒均为Promega公司产品， pUCmT载体为上海博亚公司产品。Kpn Ⅰ、 Xho Ⅰ、 T4 DNA连接酶购自美国NEB公司， 基因组抽提试剂盒、 DNA凝胶回收试剂盒购自北京天为时代公司。DMEM培养基、 RPMI1640培养基购自Gibco公司， LipofactinamineTM2000购自美国Invitrogen公司， 双荧光报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司， 定点突变试剂盒购自美国Stratagene公司。电转仪为美国BioRad公司产品， TD20/21化学发光检测仪为美国Promega公司产品， ND100微量紫外分光光度计为德国Nanodrop公司产品。J558L细胞采用RPMI1640培养液， 293T和HeLa细胞采用DMEM培养液。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠BCMA基因片段的扩增、 克隆及序列分析 抽提小鼠骨髓瘤细胞J558L基因组， 设计PCR引物， 上游引物含KpnⅠ酶切位点及保护碱基“GG”， 下游引物位于翻译起始位点“ATG”前， 含XhoⅠ酶切位点及保护碱基“CCG”。以J558L细胞基因组为模板， 扩增BCMA基因上游序列-820～+145片段。引物在北京三博远志公司合成， 设计如下: PB820F: 5′GGGGTTCCGAGACAGGATCTTGCTGTG3′; PB820R: 5′CCGCTCGAGGAGGGACTGGATCACTGAAA3′。 PCR反应条件: 95℃， 5 min; 94℃， 60 s， →61℃， 60 s， →72℃， 90 s， 30个循环; 72℃， 10 min。970 bp PCR产物经8 g/L凝胶电泳回收并纯化， TA克隆入pUCmT载体， 转化大肠杆菌DH5α， 挑出白色菌落， 得到TB820， 经KpnⅠ/ XhoⅠ双酶切鉴定， 并于三博远志公司测序鉴定。

　　1.2.2 BCMA基因报告载体的构建及鉴定 设计不同PCR上游引物， 含KpnⅠ酶切位点及保护碱基“GG”。下游引物相同， 位于翻译起始位点“ATG”前， 含XhoⅠ酶切位点及保护碱基“CCG”， 序列设计为BCMAR: 5′CCGCTCGAGGAGGGACTGGATCACTGAAA3′。分别扩增BCMA基因5′上游序列 -820～+145、 -607～+145、 -359～+145、 -157～+145、 -93～+145 5个片段。上游引物名称、 扩增片段大小、 上游引物序列 如下: (1)BCMA820（965 bp）: 5′GGGGTTCCGAGACAGGATCTTGCTGTG3′; (2)BCMA607（752 bp）: 5′CGGGGTACCGGATGTATACTGGATTGTCG3′; (3)BCMA359（504 bp）: 5′CGGGGTACCGTCATAGTTGACAGATTCC3′; (4)BCMA157（302 bp）: 5′CGGGGTACCTTGCAACTGTTACCTGGGT3′; (5)BCMA93（238 bp）: 5′CGGGGTACCCAGGAATAGTTTGCTGTGA3′。

　　1.2.3 BCMA基因删除片段装入报告基因载体pGL3Basic 以TB820为模板， 用上述5对引物行PCR扩增。再将965、 752、 504、 302及238 bp PCR产物经8 g/L凝胶电泳回收并纯化， 溶于50 μL ddh3O中。用KpnⅠ/XhoⅠ双酶切各PCR产物 及pGL3Basic。胶回收 965、 752、 504、 302及238 bp片段及pGL3Basic 4791片段。用T4连接酶连接各PCR产物双酶切片段与pGL3Basic 4791片段， 将以上各连接产物用2×TSS一步法转化大肠杆菌JM109， 转化后得到pGL3B820、 pGL3B607、 pGL3B359、 pGL3B157、 pGL3B93。将转化菌落提取质粒后， 经KpnⅠ/ XhoⅠ双酶切鉴定， 并于三博远志公司测序鉴定。

　　1.2.4 报告基因载体转染细胞 三种细胞各分7 组: (1)pGL3Basic组; (2)pGL3B820组; (3)pGL3B607组; (4)pGL3B359组; (5)pGL3B157组; (6)pGL3B93 组; (7)无质粒空白对照组。各组均以pRLTK作为内参照。293T和HeLa细胞采用脂质体LipofectamineTM2000转染。J558L细胞采用电转， 电转仪电击条件: 电容950 μF， 电压260 V。放电后1～2 min取出电转杯， 冰浴10 min。

　　1.2.5 荧光素酶活性检测 转染24 h后， 按Promega试剂盒DualLuciferase Rporter Assay System技术手册操作。记录海肾荧光素酶检测值及荧火虫荧光素酶/海肾荧光素酶比值。

　　2 结果

　　2.1 BCMA基因片段克隆

　　2.1.1 PCR扩增BCMA基因5′上游序列-820～+145片段 以J558L细胞基因组为模板， 采用高保真Taq聚合酶， 扩增出大小为965 bp的小鼠BCMA基因5′上游序列-820～+145片段（图1）。

　　图1 BCMA基因5′上游序列-820～+145片段扩增结果（略）

　　Fig 1 PCR fragment of BCMA gene 5′flanking -820～+145 regions

　　M: DNA marker; 1: 965 bp fragment.

　　2.1.2 PCR产物的克隆和序列分析 PCR产物经纯化后， 装入pUCmT载体， 转化大肠杆菌DH5α， 挑取含有目的片段的克隆， KpnⅠ/XhoⅠ双酶切结果(图2， 含2.7 kb T载体片段和965 bp目的片段)。序列测定结果与GenBank(GI: AC165252)一致。

　　图2 pUCmBCMA的酶切鉴定（略）

　　Fig 2 pUCmBCMA vector digested by restriction enzyme

　　M: DNAmarker; 1: pUCmBCMA plasmid; 2-3: pUCmBCMA digested with Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ.

　　2.2 小鼠BCMA基因报告载体的构建及鉴定

　　2.2.1 不同长度的小鼠BCMA基因5′上游序列片段的扩增 以J558L细胞基因组为模板， 分别扩增BCMA基因5′上游序列 -820～+145、 -607～+145、 -359～+145、 -157～+145、 -93～+145 5个片段(图3)。PCR扩增出965、 752、 504、 302及238 bp的目的片段（图4）， 与设计大小相符。

　　图3 BCMA基因5′上游各删除序列荧光素酶报告载体构建示意图（略）

　　Fig 3 Sketch map for construction of series of BCMA promoter luciferase report plasmids containing 5′ flanking deletion

　　图4 小鼠BCMA基因5′上游序列片段的PCR扩增结果（略）

　　Fig 4 PCR products of mouse BCMA gene 5′ flanking fragment deletion

　　M: DNA marker; 1: 238 bp fragment; 2: 302 bp fragment; 3: 504 bp fragment; 4: 752 bp fragment; 5: 965 bp fragment.

　　2.2.2 重组质粒鉴定 (1)五个重组质粒pGL3B820、 pGL3B607、 pGL3B359、 pGL3B157、 pGL3B93均被KpnⅠ/XhoⅠ双酶切， 释放出相应小片段(图5)， 表明克隆成功。(2)pGL3B820、 pGL3B607、 pGL3B359、 pGL3B157、 pGL3B93菌株经北京三博远志公司测序鉴定， 以RVprimer3为正向测序引物， 碱基序列与AC165252 BCMA 5′上游序列完全相同。

　　图5 重组质粒的酶切鉴定（略）

　　Fig 5 Identification of recombinant plasmids by restriction enzyme

　　M: DNA marker; 1: pGL3Basic plasmids; 2: 4 791 bp fragment digested from pGL3Basic; 3: pGL3B93 digested with KpnⅠ/XhoⅠ; 4: pGL3B157 digested with KpnⅠ/XhoⅠ; 5: pGL3B359 digested with KpnⅠ/XhoⅠ; 6: pGL3B607 digested with KpnⅠ/XhoⅠ; 7: pGL3B820 digested with KpnⅠ/XhoⅠ.

　　2.3 荧光素酶活性检测 5种报告基因载体在3种细胞中活性水平差异程度基本相似， 5种5′删除体的转录活性由大到小为pGL3B157&>pGL3B607&>pGL3B359&>pGL3B93&>pGL3B820(图6)。

　　图6 不同重组质粒在不同细胞表达的荧光素酶的活性（略）

　　Fig 6 Relative luciferase acting of recombinant plasmids in different cells

　　3 讨论
　　
　　随着报告基因技术及其检测方法的不断改进， 荧光素酶、 绿色荧光蛋白以及新近克隆出的红色荧光作为无害的检测工具， 在检测活体组织和细胞基因表达、 研究疾病发病发生的分子机制、 基因治疗和药物开发等方面发挥重要作用［5， 6］。目前的报告基因有氯霉素乙酰基转移酶(chlorampheni2 col acetyltransferase， CAT)、 β半乳糖苷酶、 分泌性碱性磷酸β酶、 荧光素酶(luciferase， Luc)等［7， 8］， 这些方法各有其优缺点， 可根据不同的实验条件做相应的选择。本研究构建的报告基因载体为Luc 表达载体， 在检测的敏感性上与CAT大体相当， 而且不需进行同位素标记， 操作简单敏感性好。随着不断开发出新的发光试剂， 也使其发光反应变得更加持久与稳定。
　　
　　要进行BCMA启动子活性及转录调控的研究， 首先必须对上游调控序列进行克隆， 对BCMA 的5′UTR已知的900 bp进行克隆国内外未见报道。PCR克隆产物经酶切及测序鉴定， 结果与GenBank (GenBank 号AC165252) 比较， 未见1个碱基突变及缺失， 说明通过PCR 对BCMA 5′U TR 965 bp的克隆完成。为开展BCMA其他的调控研究提供了直接可利用的基因。
　　
　　实验中我们首先将BCMA 的5′UTR 调控序列与报告基因联接， 构建一通过目的基因调控报告基因表达的完整的质粒载体。在转染细胞后， 通过细胞自身或外源DNA 表达的转录因子， 作用于基因调控序列。如果转录因子对目的基因调控序列存在反式调控作用， 此调控序列就会引发报告基因的表达。由于报告基因的表达量是可以检测并能进行定量分析， 因而即可反映蛋白对调控基因的作用。
　　
　　对小鼠BCMA基因5′上游进行生物信息学分析， BCMA基因5′上游序列无典型的TATA和CAAT盒， 存在oct1， cdxA， cmyb等数个高度保守的潜在转录因子结合位点， 存在两个可能的转录因子Blimp1结合序列［9］。采用PCR技术， 扩增小鼠基因组DNA中BCMA基因5′上游序列 -820～+145、 -607～+145、 -359～+145、 -157～+145、 -93～+145 5个片段。构建了由上述5个片段驱动的报告基因载体pGL3B820、 pGL3B607、 pGL3B359、 pGL3B157、 pGL3B93， 瞬时转染J558L细胞、 HeLa细胞及293T细胞， 通过测定荧光素酶的表达活性， 观察BCMA基因5′上游序列片段5个删除序列在不同细胞内活性的差异， pRLTK作为内对照， 可 提供实验的归一化条件， 消除细胞数目、 细胞转染和裂解效率的差异。结果显示， 5种报告基因载体在3种细胞中活性水平差异程度基本相似， 5种5′删除体的转录激活性由大到小为pGL3B157&>pGL3B607&>pGL3B359&>pGL3B93&>pGL3B820。由于pGL3B93的启动子活性仍为无启动子的pGL3Basic的5～6倍， 提示BCMA的核心启动子可能存在于其上游序列的-93～+145区域中， 此区域集中了预测的转录因子结合位点， 说明转录因子参与了BCMA基因的表达调控。荧光素酶图形显示， 片段-(-93/+145)到(-157/+145)活性增加， 提示-157/-94 区域具有基本的正调控元件。片段(-359/+145)与(-157/+145)和(-607/+145)相比， 荧光素酶活性下降， 表明-359/-158区域存在抑制元件。 结果显示， pGL3B157在3种细胞中的转录激活能力为J558L&>HeLa&>293T， 且在J558L中的转录激活能力明显强于HeLa和293T细胞。J558L为具浆细胞表型的小鼠骨髓瘤细胞， HeLa为人子宫颈癌细胞， 293T细胞来源于人胚肾上皮细胞。pGL3B157在3种细胞中的转录激活能力的差异主要原因可能在于J558L细胞中具有HeLa、 293T所不具有的转录因子， 可反式调控BCMA基因的转录， 如Blimp1可上调BCMA基因的表达， 而在HeLa、 293T等细胞中无Blimp1的表达。另外BCMA启动子的表达可能具有一定的细胞类型特异性， 在B淋巴细胞类型的细胞中表达较高。但pGL3B157在无Blimp1表达的HeLa、 293T细胞中都有荧光素酶活性， 说明BCMA 5′上游核酸序列还存在其它转录因子的顺式作用元件。
　　
　　本研究初步探索了BCMA基因的5′上游序列在不同细胞中转录活性的差异和BCMA 5′上游序列不同区域转录活性的差异， 分析了BCMA的核心启动子。对研究调控区中顺式作用元件与之发生相互作用的反式作用因子， 及阐明BCMA基因的表达调控机制有重要意义。

参考文献

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