抗HBs mAb的研制及其对野生与免疫逃逸变异 HBsAg的交叉反应特征

　　 作者：李方和， 张小燕， 严兵△， 张波， 黄永国， 张春燕， 龚劲松， 陈妍， 刘静华

【摘要】 　　目的: 抗HBs G6 mAb制备及其对重组野生与免疫逃逸变异HBsAg结合能力与特点的评价。方法: 常规制备并纯化抗HBs mAb， 以纯化抗HBs mAb IgG包被， 采用ELISA对17种野生及“a”决定簇替代性变异全基因重组表达HBsAg进行检测， 并与几种市售HBsAg检测试剂进行比较。结果: 该杂交瘤细胞生长与分泌特性稳定， 其培养上清与腹水效价分别为2048及4096×103; 对野生HBsAg检测（ELISA）敏感性不低于0.125 μg/L。该抗体可与15种变异抗原中12种发生反应（P/N≥2.5）， 反应信号强度分别为低反应组（2份， 与野生株A值比较， 下同）平均7.55%; 中反应组（1例）为59.40%; 高反应组（9种）分别为野生株的92.1%～109.4%， 低反应或无反应表达产物的免疫逃逸变异部位集中在HBV“a”决定簇I环的起始部即120～124序列之间。部分表达产物采用市售试剂作同步检测， 平均显色强度高于或明显高于几种国内应用最为普遍的HBsAg ELISA（P&<0.05 )。结论: 抗HBs G6 mAb对多数免疫逃逸变异HBsAg有很强的结合能力， 所针对的变异类型亦表现出某种特殊的规律。

【关键词】 乙型肝炎病毒 基因变异 HBsAg 免疫逃逸 ELISA

　　[Abstract] AIM: To prepare monoclonal antibodies against HBsAg and estimate its binding capacity to both wildtype and varies of immune escape mutanttype HBsAg. METHODS: Using selfmade the antiHBs G6 mAb and HRPlabeled goat antiHBs antibody， A sandwich ELISA for detection both wildtype and varies of immune escape mutanttype HBsAg has been developed. Applying this assay， to detect 17 species of whole gene wildtype and recombination expressed HBsAg which varied in “a” determinant. to evaluate its clinical application characteristic of this assay， we used the other commercial reagents to Comparing with it. RESULTS: One strain hybridoma cell lin secreted antiHBs mAb (defined G6)， was obtained. It grew stably and the titers of the culture supernatant and hydroperitoneum were 2 048 and 4 096×103. The sensitivity to the wildtype HBsAg of this assay was less than 0.125 μg/L. This antiHBs mAb can bind with 12 in 15 species mutant HBsAg (P/N≥2.5)， and 2 of them were low absorbent value at 450 nm(A450) group which was 7.55 percent of the wildtype， 1 of them was middle A450 value group which was 59.40 percent of the wildtype， 9 of them were high A450 value group which was 92.1-109.4 percent of the wildtype. The low A450 value group and the negative group were persified in 120-124 basyl in I loop of the HBV “a” determinant. We also used other commercial reagents， which was widely used in clinic， to detect partial species mutant HBsAg， the average A450 value was less than foregoing assay. CONCLUSION: The G6 antiHBs mAb was able to bind most of the immune escape mutant HBsAg in the test. And there would be some special regulations between the mutant site and the recombination expressed HBsAg binding capability.

　　[Keywords]HBV; gene variation; HBsAg; immune escape; ELISA

　　乙型肝炎病毒感染流行范围广， 感染人数多， 是目前全球最为严重的公共卫生问题之一。该病毒的DNA多聚酶缺乏校对功能， 较其他病毒更易形成遗传变异， 一旦变异发生在某些特定基因区段（如S基因“a”决定簇）， 即可引起所表达蛋白（HBsAg）的抗原性发生漂移或明显漂移， 从而形成HBV免疫逃逸变异株（hepatitis B virus immune escape mutant strain， HBV IEMS）。由于这类变异病毒在体内不能为针对野生HBV的保护性免疫中和， 在体外其HBsAg不能为多数现行市售试剂所检出， 其存在势必造成部分HBV感染者临床诊断困惑， 献血员筛查漏检， 及其血清流行病学调查失真， 已受到国内外学者的广泛关注[2， 3]。作者所在单位自上世纪末即高度关注这一现象， 并为此进行大量的研究。新近又获得一株能与多数免疫逃逸变异（IEM）HBsAg有极强结合能力的单克隆抗体（细胞克隆序号G6B3F1， 分泌物简称抗HBs G6 mAb）， 并对其与HBV“a”决定簇变异重组表达产物的结合特征进行了初步的评价。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 BALB/c小鼠由湖北省疾病预防控制中心动物室提供; HBV Dane颗粒、 全基因重组野生HBsAg及Al(OH)3凝胶由卫生部武汉生物制品研究所提供; Sp2/0细胞由中国典型培养物保藏中心提供; RPMI1640培养基购自Gibco公司; PEG、 HAT、 HT以及鼠免疫球蛋白亚类检测试剂等购自Sigma公司; 羊抗鼠IgG及HRP标记的羊抗鼠IgG购自美国Pierce公司; HRP标记羊抗HBs、 部分HBsAg ELISA试剂盒自市售获得; 抗HBs A11 mAb与抗HBs Mt mAb由中科院武汉病毒研究所提供; 乙肝病毒G145R变异表面抗原由本室既往制备; 其他多种野生与IEM重组全基因S蛋白表达产物（表1）由本院临床免疫研究室收集并提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 抗HBs G6 mAb的制备 按文献报道[4]。常规免疫小鼠， 融合及有限稀释法制备杂交瘤细胞; 降植烷诱导法制备腹水; 采用紫外比色（以BSA为标准）测定腹水中总蛋白含量。抗HBs G6 mAb IgG的纯化采用辛酸硫酸铵沉淀法。

　　1.2.2 G6ELISA的建立 采用纯化抗HBs G6mAb IgG包被， 羊抗HBsHRP示踪， 建立双抗体夹心ELISA。主要操作为(1)将抗HBs G6mAb IgG以pH9.6的碳酸缓冲液稀释， 加入酶标反应板各孔中， 4℃放置过夜; （2）以PBST洗涤5次， 加入20 g/L BSA（150 μL/孔）， 置37℃ 2 h， 甩干; （3）加入待测或对照标本（100 μL/孔）， 37℃反应30 min; （4）同上洗板， 每孔加入100 μL羊抗HBsHRP， 37℃反应30 min; （5）同上洗板， 加入TMBh3O溶液显色15 min， 以2 mol/L h3SO4终止反应， 置酶标仪上测定A450值， 以P/N≥2.1判为阳性。

　　1.2.3 阻断试验 在上述G6mELISA的基础上进行， 主要操作为MT mAb或A11 mAb包被; 包被; 加入与不同抗HBs G6 mAb IgG预温（30 min）后的rwHBsAg或rG145R HBsAg反应; 加入HRP标记羊抗HBs反应; 加入TMBh3O溶液显色， 同上测定A450值， 并与未中和孔比较计算实验孔显色抑制百分率。

　　1.2.4 常规HBsAg ELISA检测 其他多种HBsAg ELISA检测参照试剂说明进行。

　　1.2.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据统计分析， 结果以P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 mAb的制备 采用常规细胞融合制备杂交瘤细胞， 以间接ELISA对其抗体的特异性与分泌能力进行筛选， 经3次克隆化（有限稀释法）后获得能高效分泌抗HBs IgG6 mAb的G6B3F1杂交瘤细胞系。以降植烷诱导法制备腹水， 并以辛酸硫酸铵沉淀法纯化， 产物即为抗HBs G6 mAb IgG。采用紫外比色及其双抗体夹心ELISA对细胞培养上清、 腹水及纯化产物进行检测， 杂交瘤上清抗HBs效价为2048， 后二者蛋白含量及效价分别为11.2±3.16 g/L与4096×103， 以及3.6 g/L与1 024×103。

　　2.2 G6M ELISA的敏感性 采用G6ELISA对系列稀释的部颁高浓度HBsAg值控血清进行检测， 并与重组G145R变异全基因表达产物（浓缩培养上清）进行比较， 实验结果见图1。该抗体与2种不同抗原反应的显色强度大致相当， 稀释曲线斜率分别为0.716与0.729; 部颁质控血清（自然表达野生HBsAg）稀释至0.125 μg/L时仍能得到较强阳性结果（P/N值为4.5）。

　　图1 野生与G145R变异HBsAg在G6 ELISA检测中的反应性比较（略）

　　Fig 1 The comparision of the reactivity between wHBsAg and G145R mutant HBsAg in the G6 ELISA

　　2.3 变异抗原结合特征 采用同上G6mELISA对15份全基因重组“a”决定簇变异表达产物进行检测， 并与野生及非“a”决定簇变异表达产物进行比较， 实验结果（表1）。

　　表1 抗HBs G6 mAb对“a”决定簇变异重组全基因HBsAg的反应特性（略）

　　Tab 1 The reactivity of antiHBs G6 mAb to recombinational whole gene HBsAg which varied in “a” determinant

　　*: Take the average A450 of Gly Dr and Gly Dw as 100%; **: The A450 of nontransfection supernatant control was 0.06.

　　G6mAb能与15种参与研究的IEM HBsAg中的12种发生反应， 对其中9种IEM HBsAg在 ELISA中的显色信号超过rwHBsAG产物的90%。(2)以羊抗HBs HRP取代各自示踪抗体， 采用5种不同市售试剂对12种基因重组“a”决定簇变异表达产物进行检测， 以重组野生全基因表达产物（2种）的同期检测信号为基数计算各表达产物的平均显色率（%）， 并与G6mELISA进行比较。实验结果(表2)。

　　表2 不同ELISA对部分重组免疫逃逸变异HBsAg检测能力的比较（略）

　　Tab 2 The comparision of the detection capability to partial recombination immune escape mutant HBsAg

　　*: Reaction intensity rank: high≥80%; Middle 30%～80%; Low≤30%; **: Compared with G6mELISA; #: Coated with multiclone antibody.

　　2.4 抗HBs G6 mAb抗原结合位点分析 采用不同纯化抗HBs MT与A11 mAb分别包被反应板， 以纯化抗HBs G6 mAb为阻断抗体， 通过双抗体夹心ELISA阻断试验分析抗HBs G6 mAb与其他抗HBs mAb在抗原结合位点上的差别， 实验结果（表3）显示抗HBs G6 mAb 能同时阻断MT mAb跟rwHBsAg与rG145RHBsAg 2种抗原的反应; 其有效阻断（即产生50%以上阻断率）浓度前者几乎较后者低一个数量级。A11与rwHBsAg的反应可为高浓度抗HBs G6 mAb阻断， 其与rG145R HBsAg的反应未显示出明确的检测信号。同上反应条件下， 对抗HBs A11 mAb与抗HBs MT mAb二者相互做中和试验。在饱和包被， 以野生HBsAg为抗原， 中和抗体分别为100 mg/L浓度下， 二者平均阻断率仅为6.83%及1.45%。

　　表3 抗HBs G6 mAb抗原结合表位的初步分析（略）

　　Tab 3 The initial analysis to antigen binding epitope of the antiHBs G6 mAb

　　*: Interrupted hole A value/interruption rate; **: Anti HBs A11 mAb cannot react to rG145R HBsAg under this coating concentration， interruption test cannot be effective.

　　上述结果表明抗HBs G6 mAb， A11 mAb及MT mAb所针对的均为HBsAg上独立的抗原决定簇; 前二者所对应抗原决定簇在rwHBsAg分子的距离（包括结构与空间距离）较大但仍有一定的相关性; 抗HBs G6 mAb能较好阻断抗HBs MT mAb对野生与G145R HBsAg的结合， 但其阻断能力存在明显差别， 提示它们所针对抗原决定簇的空间距离较其与抗HBs A11 mAb显然要近。该实验显示抗HBs G6 mAb对2种抗原在结合能力上的差别， 推测为G145R变异所致变异蛋白空间结构改变所带来的影响。

　　3 讨论
　　
　　和野生HBV一样， HBV IEMS感染临床诊断与流行病学的研究亦应包括对基因、 抗原及抗体等不同层面标志的检测。这些标志检测的方法、 阳性率及其阳性覆盖面各异， 临床意义亦各不相同。国内外对血清IEM HBsAg临床漏检的认识与研究起源于上世纪90年代初， 重新启用多克隆抗HBs， 采用抗HBsAg非“a”决定簇区段的高亲和力抗体， 以及研制一组针对不同IEMHBsAg“a”决定簇的mAb作包被抗体， 所研发的标记免疫学试剂虽不能确证单个HBV IEM感染的临床诊断， 但能明显提高HBV IEM感染的临床检出率， 并进而最大限度防止因感染者漏检而引发的公共卫生问题。我国自2000年以来部分国产ELISA试剂在一定程度上具备了对IEM HBsAg的检测能力， 但迄今仍未能开发出检测效果与雅培化学发光类似的诊断产品。作者长期从事mAb制备与传染病的临床诊断研究， 经较长时期努力成功地制备出抗HBs G6 mAb杂交瘤细胞株。系统的鉴定结果显示该细胞株具有较高的抗体分泌能力， 其分泌产物的特异性、 强硬度及其与靶物质的免疫亲和力与当前市售ELISA试剂所采用的抗体相当或更优（部分资料未显示）， 以此建立的G6 ELISA对野生HBsAg检测的敏感性高于0.125 μg/L。
　　
　　进一步分析显示该抗体对IEM rHBsAg的结合具有以下特点。（1）对IEM rHBsAg检测的覆盖面较既往多数报道明显为宽（12/15）， 其反应强度呈现一种非高即低的鲜明特点， 对IEM rHBsAg的检测能力明显优于多数现行市售试剂[5]; （2）对“a”决定簇II环的139、 145、 144、 143、 142等位点替代性突变质粒表达产物的结合能力与重组野生HBV S抗原大致相当， 对“a”决定簇I环起始部及其附近如120、 122、 123、 124等位点替代性突变质粒表达产物的结合能力明显降低; （3）对“a”决定簇I环内126位点突变产物的结合能力与野生株相当， 对129位点突变表达产物的结合视取代氨基酸不同而存在较大差别; （4）与多点突变质粒表达产物的结合未表现出明显的倾向性， 但“a”决定簇II环中后部的变异似乎可在一定程度上纠正因I环起始部变异造成的反应性低下。突变部位在亲水区“a”决定簇以外IEM产物与该抗体的结合与野生株雷同。有关IEM产物结构与抗原性漂移程度之间的关系已引起国内外学者较多关注， 但其研究结果尚不足以阐述其间的内在规律。国内何建文、 刘芳等在对129H及129L的研究中发现原始与替代氨基酸之间亲水性差异的大小是导致IEM变异产物对原有（即针对野生株）抗体结合力下降的主要原因[6]。 Hou等发现2例aa121～124位之间插入性突变的IEM HBV感染者， 其IEM HBsAg即便采用抗HBs多克隆抗体仍不能测及[7]。这些发现均为本研究所印证。鉴于122和160位氨基酸二者同为决定HBV血清型的关键部位[8]， 本研究结果除表明重度抗原性漂移与变异部位高度相关外， 还提示某些特定部位（如抗HBs G6 mAb对应抗原位点）抗原性的漂移与HBV组决定簇存在某种特殊的关联。
　　
　　阻断实验结果显示， 抗HBs A11与抗HBs MT mAb所对应的是2个在血清学反应上相互独立的抗原位点， 抗HBs G6 mAb能阻断抗HBs A11与抗HBs MT二者对rwHBsAg的反应， 但其阻断能力不强， 对前者的阻断作用明显低于后者， 提示抗HBs G6 mAb所对应抗原决定簇在一级结构上与前二者无关， 且与抗HBs A11 mAb对应抗原位点的空间距离明显大于与抗HBs MT mAb。鉴于抗HBs A11 mAb在我国早期HBsAg ELISA检测中应用较多， 其抗HBV“a”决定簇（或其附近位点）特异性最为明确， 推测抗HBs G6 mAb所对应的抗原决定簇表位在氨基酸序列上与HBV“a”决定簇存在一定的距离。资料还显示， 抗HBs G6对抗HBs MT mAb与rwHBsAg结合的阻断效果明显低于对其与G145R HBsAg结合的阻断， 提示抗HBs G6 mAb对后者的亲和力至少不低于对rwHBsAg。而正是这种对G145R及其他IEM HBsAg的高亲和力特征彰显出该抗体在IEM HBsAg临床诊断与流行病学研究中重要的理论与实用价值。

参考文献

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