阿糖胞苷上调白血病细胞CD86分子及细胞因子表达的研究

　　 作者：范冬梅， 杨铭， 贾海荣， 高瀛岱， 王金宏， 纪庆， 熊冬生， 杨纯正

【摘要】 　　目的: 观察阿糖胞苷（AraC）对急性白血病细胞CD86分子表达的影响， 并探讨其作用机制。方法: 流式细胞术(FCM)检测U937、 HL60、 NB4细胞经AraC处理前后CD86分子表达变化， RTPCR检测AraC对各组细胞 CD86 mRNA、 NFκB以及细胞因子IFNγ的表达变化。结果: 经AraC处理的急性白血病细胞CD86分子表达与对照组相比均明显升高（P&<0.05）; CD86 mRNA表达水平也明显增强; AraC处理后细胞核内NFκB表达明显上调; 并且IFNγ mRNA在T细胞活化72 h可检测到。结论: AraC能使U937、 HL60、 NB4急性白血病细胞CD86表达增加， 有利于NFκB等转录因子活化， 促进CD86转录增强、 表达增加并可有效地增强肿瘤细胞的免疫原性， 激活T细胞， B72在T细胞活化中起着更重要的作用。

【关键词】 阿糖胞苷 NF κB CD86 T细胞 细胞因子

　　［Abstract］ AIM: To observe the effects of Arac on the expression of CD86 molecule on acute leukemia cells and explore the possible mechanisms. METHODS: The expression of CD86 on U937， HL60 and NB4 cell lines treated with or without AraC wa assayed by flow cytometry. The mRNA expression of CD86， NFκB， IFNγ was examined by semiquantitative RTPCR. RESULTS: UPregulation of CD86 was observed on those cells treated by Arac. The leve of CD86 and NFκB mRNA in Arac treated cells was significantly enhanced. IFNγ was detectable 72 hours after T cell activation. CONCLUSION: AraC can enhance CD86 and NFκB expression on acute leukemia cells， which may play critical role in T cell activation and differentiation.

　　［Keywords］Arac; NFκB; CD86; T cell; cytokine

　　在肿瘤免疫反应中， 肿瘤细胞即使表达高水平的MHCⅠ和Ⅱ类抗原并存在特异性的肿瘤肽， 在缺乏适宜的共刺激信号时也不能有效地诱导T细胞活化和增殖［1］ 。共刺激信号不是抗原特异性的， 亦不受MHC限制 。 B7/CD28共刺激信号与第1信号协同， 能上调细胞因子的表达， IL2 mRNA转录增加， 使T细胞从细胞周期的G0期进入G1期， 有助于T细胞大量增殖。在T细胞膜上有多种共刺激分子与第2信号产生有关， 例如 LFA1、 VLA4及CD28等， 其中以CD28分子最重要。这条信号通路的作用已在鼠模型中显示， 它证实了B7CD28/CTLA4在自身免疫性疾病， 肿瘤免疫和同种异体排斥反应中的重要作用。B7家族分子（包括B71和B72等）是激发免疫应答的重要协同刺激分子。B72也称CD86， 相对分子质量(Mr)为50000的跨膜糖蛋白， 基因定位于3q21， 属免疫球蛋白超家族(IGSF)成员之一， 主要表达在抗原提呈细胞(APC)上［2， 3］ 。B72既参与T细胞的活化，免疫应答的维持与调节［4］， 同时也参与细胞介导的免疫应答［5］。本实验中选用不表达或低表达B72分子的急性白血病细胞作为研究对象， 体外观察经AraC刺激后B72的表达， CD86的上调与核转录因子的关系， 以及在对T细胞介导的特异性细胞免疫中的作用， 为进一步研究急性白血病的发病机制及免疫治疗奠定了实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 阿糖胞苷（Cytarabine， AraC）购自法玛西亚公司。小鼠抗人 CD86/PE 标记抗体、 小鼠 IgG1 PE标记抗体， 均购自晶美生物工程有限公司。胎牛血清购自中国医学科学院血液学研究所科技公司。TRIzol reagen总RNA提取试剂盒、 RPMI1640培养干粉为Invitrogen公司产品。流式细胞仪为美国BectonDikinson公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞株及细胞培养 U937、 HL60及NB4细胞悬浮培养于含100 mL/L的灭活胎牛血清RPMI1640培养液中， 置于50 mL/L CO2， 饱和湿度的37℃培养箱中培养， 隔天传代培养， 取对数生长期的细胞用于实验。

　　1.2.2 流式细胞术(FCM)检测CD86的表达 收集对数生长期的U937、 HL60和NB4细胞， 调整细胞密度为1×109/L， 加入终浓度为0.25 μmol/L的AraC作用72 h， 对照组加入等体积的PBS。收集细胞， 用PBS洗2次， 分别加入PE标记的CD86抗体， PBS洗2次。CD86同型对照为Mouse IgG1 PE标记抗体， 用FCM检测［6］。激发光为氩离子激光488 nm， 每个样品测定10000个活细胞数。其结果用CELL Quest软件分析。

　　1.2.3 RTPCR测定CD86 mRNA的表达 取对数生长期的U937、 HL60、 NB4细胞， 调整细胞密度， 分别加入终浓度为 0.25 μmol/L的AraC作用72 h， 以未加AraC刺激的细胞作为对照组。收集细胞按照TRIzol说明书操作步骤提取细胞总RNA， 取适量DEPC水溶解沉淀， 紫外分光光度计定量。分别各取10 μg总RNA， 进行逆转录， 引物由Invitrogen生物技术有限公司合成， 扩增条件为: 94℃， 40 s， 52℃， 30 s， 72℃， 1 min， 30个循环， 行15 g/L agarose凝胶电泳， 扩增产物为488 bp。以βactin为内对照。引物序列设计如下: CD86: 上游引物 5′GGGGGATCCATGGGCAATCCTTAT3′; 下游引物 5′TCGGGTGACCTTGCTTAGACGTGCAGG3′; βactin: 上游引物 5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′; 下游引物 5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′。

　　1.2.4 RTPCR分析核转录因子NFκB的表达 收集经0.25 μmol/L AraC处理72 h的U937、 HL60和NB4细胞以及对照组细胞， 提取细胞的总RNA， 以βactin为内对照， 进行逆转录。引物NFκB， βactin， 均由Invitrogen生物技术有限公司合成， PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后， 紫外透射仪分析图象并拍照。引物序列设计如下: NFκB: 上游引物 5′ACGATCTGTTTCCCCTCATC3′; 下游引物 5′TGCTTCTCTCCCCAGCAATA3′。

　　1.2.5 RTPCR检测混合淋巴细胞反应中IFNγ mRNA的表达 将急性白血病细胞U937、 HL60、 NB4用终浓度为0.25 μmol/L AraC刺激72 h， 作为混合淋巴细胞培养中的刺激细胞， 用培养基洗1次， 室温2000 r/min， 离心5 min 。台盼蓝染色， 计数活细胞数， 然后用培养基调整细胞密度1×108/L。反应细胞的制备: 常规分离健康人外周血单个核细胞(PBMNC)， 用培养基调整细胞密度为1×1010/L， 接种于培养瓶中， 50 U/L白细胞介素2(IL2)培养3 d。收集细胞， 用培养液洗1次， 然后进行活细胞计数， 再用培养基调整细胞密度为4×109/L。将制备好的反应细胞和刺激细胞， 按照一定的效靶比加入6孔培养板中， 设未经处理的刺激细胞和反应细胞作为对照组。于37℃、 50 mL/L CO2孵箱中继续培养72 h。收集混合淋巴细胞， 提取细胞的总RNA。RT反应合成cDNA第1链的体系25 μL， 含有2 μg总RNA， 5×AMV逆转录缓冲液4 μL， 10 mmol/L dNTP2 μL， AMV逆转录酶10 U， 随机引物1 μL， 于PCR仪上42℃反应1 h， 95℃灭活5 min， 冰上冷却5 min， 置-80℃保存。PCR反应体系25 μL， dNTP(10 mmol/L) 0.5 μL， 10×缓冲液2 μL， Taq DNA聚合酶1 U， cDNA 2 μL， IFNγ引物各1 μL， 以βactin为内参照。引物由天津厚普生物工程公司合成。反应条件: 94℃预变性5 min， 94℃ 30 s， 57℃ 1 min， 72℃ 2 min， 循环35次， 72℃延伸7 min。PCR产物经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳后， 紫外光透射仪分析图像并照相。

　　2 结果

　　2.1 AraC上调急性白血病细胞CD86分子表达 U937、 HL60和NB4细胞经AraC处理72 h后CD86分子的表达较对照组均有不同程度的提高（图1）。说明0.25 μmol/L的AraC与细胞作用72 h后能够上调CD86分子的表达。

　　图1 FCM检测0.25 μmol/L AraC处理的U937、 HL60及NB4急性白血病细胞CD86分子表达结果（略）

　　Fig 1 The expression of CD86 on acute leukemia cells treated by AraC

　　A: The control group; B: The AraC treated group.

　　2.2 AraC刺激急性白血病细胞CD86分子mRNA的表达 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后， AraC刺激的U937、 HL60和NB4细胞在488 bp处可见清晰条带， 而未经AraC处理的细胞组无条带（图2）。可见AraC刺激白血病细胞后可诱导CD86 mRNA的表达。

　　图2 AraC对U937、 HL60、 NB4细胞CD86基因的表达（略）

　　Fig 2 AraC on transcription of CD86 gene in U937， HL60 and NB4 cell lines

　　M: DNA markers; 1: CD86 gene of control group; 2: βactin gene of control group; 3: CD86 gene of AraC treated group; 4: βactin gene of AraC treated group.

　　2.3 AraC作用下U937、 HL60、 NB4细胞NFκB表达变化 0.25 μmol/L的AraC处理急性白血病细胞72 h后， 20 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析其结果表明， 一定量的AraC均能上调白血病细胞NFκB的表达（图3）。

　　图3 AraC作用U937、 HL60、 NB4细胞72 h后细胞核内NFκB的变化（略）

　　Fig 3 The content alteration of intranuclear NFκB in U937， HL60， NB4 cell lines treated with or without AraC for 72 h

　　2.4 诱导T细胞IFNγ mRNA的变化 从混合淋巴细胞培养的细胞， 逆转录后取相同量的cDNA， 以未经处理的刺激细胞和反应细胞为对照组， 分别进行IFNγ的基因扩增。RTPCR结果分析， 经AraC处理的刺激细胞和反应细胞组较未经AraC处理的刺激细胞和反应细胞组IFNγ mRNA表达明显增强（图4）。

　　图4 RTPCR分析IFNγ mRNA的表达（略）

　　Fig 4 Analysis of IFNγ mRNA expression by RTPCR

　　3 讨论
　　
　　B71与B72分子同属于CD28/CTLA4共刺激信号系统中的最重要的2个配体， 并且在氨基酸序列上还有25%的同源性。但是， 二者无论是在抗原提呈细胞(APC)表面的构成性表达谱、 表达量以及表达先后顺序方面均有较大的差异。较多的研究认为， B72分子与B71分子在功能上虽有互补， 但B72分子的作用却更占主导支配地位。肿瘤细胞表面由于缺乏共刺激分子的表达， 不能有效地激活机体的免疫应答， 使肿瘤细胞逃避免疫监视。因此， 我们选用人急性白血病细胞系U937、 HL60及NB4细胞， 经AraC刺激后， FCM检测结果表明， AraC可在不同程度上上调白血病细胞CD86分子表达。半定量RTPCR结果显示AraC刺激细胞后CD86 mRNA水平明显增高， 表明CD86的上调发生在转录水平。共刺激分子CD86是激活CTL效应的所必需的第Ⅱ类分子。多药联合化疗虽然能使急性髓系白血病获得较高的完全缓解率， 但多数患者仍难免再次复发。如何消除化疗后残存的白血病细胞始终是一大难题。经AraC诱导上调共刺激分子的白血病细胞比未经AraC作用的细胞CD86表达明显增强。如果进而培养形成肿瘤细胞源性的功能性抗原提呈细胞(APC)， 将可能应用于过继免疫治疗， 并可能最终消除微小残留病， 使患者达到长期无病生存。上述结果与Maeda等［7］报道HDACI可上调急性髓系白血病细胞系中共刺激分子CD86上调水平最高的结果相一致。
　　
　　Li等［8］报道Th细胞诱导APC中CD86基因转录是由转录因子NFκB与CD86基因启动子结合后激活引起的， 认为正常APC分子上CD86分子表达是由转录因子NFκB介导的。李薇等［9］研究结果表明丁酸钠能上调细胞核内NFκB最重要的亚基p65的含量， 且上调幅度与该细胞CD86分子的上调幅度呈正相关。我们的实验结果表明AraC刺激U937、 HL60和NB4细胞72 h后， 细胞核内的NFκB明显增多， 促进转录增强， 最终导致CD86分子在细胞表面表达增多， 表明CD86的上调发生在转录水平。AraC之所以能上调白血病细胞核内NFκB的含量， 是因为CD86启动子上游-612位点上有NFκB结合位点， CD86基因区域为转录活性结构， 有利于NFκB转录因子的活化并与之结合而促进转录增强。但AraC作用于细胞后涉及多种基因及转录因子的变化， 细胞内信号转导通路复杂， 常为多种信号相互作用， 互相协调的结果［10］， 有关Arac上调白血病细胞CD86的作用机制还需进一步阐明。
　　
　　由于肿瘤细胞表面缺乏B7分子， 不能为T细胞活化提供第2信号， 因而不能有效地刺激T细胞分泌细胞因子。我们选用U937、 HL60、 NB4细胞作为靶细胞， 按照1.25∶1、 2.5∶1、 5∶1、 10∶1、 20∶1、 40∶1 和80∶1不同的效靶比， 混合淋巴细胞反应 72 h 后， 能够诱导T细胞表达IFNγ mRNA， 可以为T细胞活化提供第2信号， 从而有效地激活T细胞， 刺激T细胞分泌细胞因子。IFNγ 能增强MHCⅠ， Ⅱ类抗原和黏附分子的表达， 能促进T细胞的活化， 因此是T细胞介导免疫反应中一个重要的放大机制。刺激白血病细胞使之高表达CD86分子及其对细胞因子产生的影响具有重要的临床应用意义。

参考文献

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