IL15和TGFβ对人PBMC上LAIR1表达的调节作用

　　　　 作者：张晓姝， 曹奇志， 王春艳， 张骞， 薛江楠

【摘要】 　　目的: 研究细胞因子IL15和TGFβ对人外周血单个核细胞(PBMC)上LAIR1表达的调节作用。方法: 以IL15和TGFβ作用于人PBMC， 流式细胞术(FCM)检测PBMC上白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)的表达。结果: 与单独PHA刺激组相比， IL15刺激72 h后细胞免疫荧光强度明显减弱（P&<0.05）， 阳性细胞百分率也有所下降; TGFβ刺激的PBMC上LAIR1表达水平也有所降低。 结论: IL15和TGFβ都可以下调PHA活化PBMC上LAIR1的表达。

【关键词】 外周血单个核细胞 白细胞相关免疫球蛋白样受体1 IL 15 TGF β 流式细胞术

　　澳大利亚的Burns等［1］用人的NK细胞免疫小鼠获得1株单克隆抗体(mAb) 9.1C3， 它能显著抑制人NK细胞、 CTL以及单核细胞的杀伤作用。1999年鉴定其所识别的分子（9.1C3分子）为一种免疫细胞抑制性受体， 并进一步证实9.1C3分子与美国DNAX研究所报道的白细胞相关免疫球蛋白样受体1 (leukocyteassociated immunoglobulinlike receptor1， LAIR1)以及Poggi等报道的p40为同一分子［2］。2004年12月召开的第8届国际人类白细胞分化抗原大会组委会（HLDA8）已将LAIR1/9.1C3分子正式命名为CD305［3］。LAIR1是胞质区含有两个ITIM模体的跨膜糖蛋白，能募集含有Sh3的酪氨酸磷酸酶1和酪氨酸磷酸酶2(SHP1、 SHP2)， 发挥抑制功能［4］。LAIR1广泛表达于白细胞， 包括NK细胞、 T细胞、 B细胞、 单核/巨噬细胞以及DC细胞， 提示LAIR1分子可能广泛参与免疫应答过程。
　　
　　本研究中通过流式细胞术(FCM)探讨了细胞因子IL15和TGFβ对人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)上LAIR1表达的影响作用， 为进一步研究LAIR1的功能奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 LAIR1单克隆抗体(mAb)由第四军医大学金伯泉教授惠赠。FITC标记羊抗鼠IgG购自HBT公司。淋巴细胞分离液为天津TBD公司产品。RPMI1640培养基为Gibco公司产品。小牛血清为杭州四季青公司产品。IL15和TGFβ购自法国Digclone公司。PHA为Sigma公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PBMC分离和培养 无菌抽取6个健康人的静脉血各5 mL， 加肝素250 U抗凝。采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。洗涤2次后加入含有100 mL/L胎牛血清的RPMI1640重悬细胞， 调至细胞密度5×108/L， 置于24孔培养板中， 37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养。

　　1.2.2 细胞因子IL15和TGFβ对PBMC的刺激 实验分为4组， 每组3复孔， 分别加入如下试剂: IL15+PHA; TGFβ+PHA; 单独PHA; 无PHA和细胞因子。其中IL15和TGFβ的用量为20 μg/L， PHA 为50 mg/L。

　　1.2.3 FCM分析PBMC上LAIR1的表达 将培养不同时间点的PBMC用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640调整细胞密度约为1×1010/L， 加入特异性mAb（LAIR1 mAb）， 再加入适量的灭活兔血清， 4℃ 30 min。用洗涤液洗涤2次后加入工作浓度的FITC标记羊抗鼠IgG（HBT公司）， 充分振摇， 4℃ 30 min。用洗涤液洗涤2次后加适量固定液， 应用FCM进行检测。

　　1.2.4 统计学处理 应用统计学软件SPSS13.0进行分析。多样本均数的两两比较（LSD）采用方差分析（ANOVA）。P&<0.05为具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 PBMC上LAIR1的表达 阳性细胞百分率结果显示PHA刺激48和72 h后LAIR1在PBMC上表达水平高于未刺激组， 刺激72 h后LAIR1表达水平明显增高（P&<0.05）。刺激72 h后细胞的平均免疫荧光强度也有所升高(图1)。

　　2.2 IL15对PBMC上LAIR1表达的影响作用 加IL15和PHA的一组与加PHA的一组相比， 阳性细胞百分率在72 h后则下降。而与加PHA组相比， IL15和PHA刺激72 h后细胞平均免疫荧光强度明显减弱(图1)。

　　2.3 TGFβ对PBMC上LAIR1表达的影响作用 与加PHA的一组相比， 经TGFβ和PHA共同刺激组阳性细胞百分率在24 h后略上调， 48 h后下降， 72 h后又有所上调; 以及平均免疫荧光强度在72 h后均有所下降(图1)。

　　图1 IL15和TGFβ对PHA 活化PBMC LAIR1表达的调节作用（略）

　　a: 未经刺激的PBMC上LAIR1的表达; b: PHA刺激的PBMC上LAIR1的表达; c: PHA和IL15共刺激的PBMC上LAIR1的表达; d: PHA和TGFβ共刺激的PBMC上LAIR1的表达.

　　3 讨论
　　
　　LAIR1是一种免疫抑制性受体， 体外研究表明， LAIR1被其相应的mAb交联后， 可传递强烈的抑制性信号， 可抑制包括NK 细胞、 效应T 细胞、 B 细胞和树突状细胞(DC)前体等多种免疫细胞的功能［5］。在B细胞、 中性粒细胞和DC分化成熟过程中， LAIR1的表达是受调控的。最近的研究证明， 在人T细胞分化过程中， LAIR1的表达也呈现分化性。与记忆性T细胞相比， 初始的CD4+T细胞、 CD8+T和效应性CD8+T表达更高水平的LAIR1分子［6］。我们在实验中也发现与无刺激组相比， PHA刺激72 h后， PBMC 上LAIR1表达水平明显增高（P&<0.05）， 说明LAIR1的表达随细胞的增殖和活化而升高， 此现象与CTLA4等抑制性受体表达相类似。
　　
　　IL15主要由单个核细胞和肥大细胞产生［7］。它与IL2具有相似的生物学活性， 可以刺激NK细胞和T细胞的产生和增殖。研究证明， IL15还具有抗肿瘤作用［8］。而TGFβ的主要功能是免疫抑制效应， 它可以广泛抑制T细胞、 B细胞和NK细胞等的增殖和功能［9］。Sheu等的研究表明宫颈癌细胞通过产生IL15和TGFβ上调CD8+ CTLs上抑制性受体CD94/NKG2A的表达， 从而抑制细胞的抗肿瘤效应［10］。而我们在实验中通过FCM检测PBMC表面LAIR1的表达情况发现: 与单独PHA刺激组相比， IL15或TGFβ加PHA刺激72 h后阳性细胞百分率与免疫荧光强度均有所下降，说明IL15和TGFβ都可以下调PBMC上LAIR1的表达。
　　
　　IL15和TGFβ都是具有重要免疫调节作用的细胞因子， 我们通过研究两种细胞因子对PBMC上抑制性受体LAIR1表达的刺激作用， 为深入探讨LAIR1表达的影响因素和功能提供了有价值的实验资料。

参考文献

　　［1］ Burns GF， Triglia T， Bartlett PF， et al. Human natural killer cells， activated lymphocyte killer cells， and monocytes possess similar cytotoxic mechanisms［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1983， 80(24): 7606-7610.

　　［2］ Ouyang W， Ma， DC， Lin D， et al. 9.1C3 is identical to LAIR1， which is expressed on hematopoietic progenitors［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2003， 310(4): 1236-1240.

　　［3］ Hilary SW. The eighth human leukocyte differentiation antigen (HLDA8) workshop: natural killer cell section report［J］. Cellular Immunol， 2005， 236: 17-20.

　　［4］ Sathish JG， Johnson KG， Fuller KJ， et al. Constitutive association of SHP1 with leukocyteassociated Iglike receptor1 in human T cells［J］. J Immunol， 2001， 166(3): 1763-1770.

　　［5］ Meyaard L， Adema GJ， Chang C， et al. LAIR1， a novel inhibitory receptor expressed on human mononuclear leukocytes［J］. Immunol， 1997， 7(2): 283-290.

　　［6］ Jansen CA， Cruijsen Carin WA， Jansen TR， et al. Regulated expression of the inhibitory receptor LAIR1 on　　human peripheral T cells during T cell activation and differentiation［J］. Eur J Immunol， 2007， 37: 1-11.

　　［7］ Giri JG， Anderson DM， Kumaki S， et al. IL15， a novel T cell growth factor that shares activities and receptor components with IL2［J］. J Leukoc Biol， 1995， 57(5): 763-766.

　　［8］ Shanmugham LN， Petrarca C， Frydas S， et al. IL15 an immunoregulatory and anticancer cytokine［J］. J Exp Clin Cancer Res， 2006， 25(4): 529-536.

　　［9］ Wan YY， Flavell RA. Regulatory T cells， transforming growth factorbeta， and immune suppression［J］. Proc Am Thorac Soc， 2007， 4(3): 271-276.

　　［10］ Sheu BC， Chiou SH， Lin HH， et al. Upregulation of inhibitory natural killer receptors CD94/NKG2A with suppressed intracellular perforin expression of tumorinfiltrating CD8+ T lymphocytes in human cervical carcinoma［J］. Cancer Res， 2005， 65(7): 2921-2929.