【摘要】 目的: 探讨利用细胞块检测肾小球疾病患者尿中足细胞和巨噬细胞及其与肾脏病理及功能损害的关系， 试图寻找一种反映肾损害的非创伤性指标。方法: 利用免疫组化测定患者尿细胞块中足细胞和巨噬细胞数， 并用HE和免疫组织化学双染技术观察肾脏活检病理切片， 用化学法测定尿蛋白、 血肌酐和尿肌酐。结果: 肾小球疾病患者尿细胞块中足细胞和巨噬细胞数目比正常对照明显增多(P&<0.01); 尿细胞块中足细胞和巨噬细胞数目与蛋白尿程度、 肾组织损害指数及肾功能损害明显相关(P&<0.01)。结论: 肾小球疾病患者尿细胞块中足细胞和巨噬细胞明显增多， 并且与蛋白尿程度、 肾组织损害指数及肾功能损害明显相关， 提示其作为一种监测肾小球疾病肾损害的非创伤性指标的可能。
【关键词】 肾小球疾病 细胞块 足细胞 巨噬细胞
足细胞(podocyte， PC)位于肾小球基底膜（glomerular basement membrane， GBM）外侧， 参与构成肾小球滤过屏障， 足细胞损伤后可与GBM剥离而从尿液排出， 肾小球滤过膜完整性遭到破坏［1］， PC损伤、 密度和数量减少已成为肾小球疾病发生机制之一［2， 3］。另外， 从肾小球肾炎的发病过程中的动物模型和人体肾活检标本均发现， 巨噬细胞在肾组织中明显渗出［4， 5］。所以监测尿中足细胞及巨噬细胞可成为一个较好无创伤性判断肾脏细胞增殖情况和肾损伤的指标。但是尿中足细胞与巨噬细胞具有数量较少、 不能长期保存、 不能溯源和会诊的特点。我们发现用细胞块切片做免疫组化染色能解决以上不足， 并与肾活检、 尿蛋白和肌酐清除率(endogenous creatinine clearance， Ccr)作对照， 探讨了肾小球疾病患者蛋白尿程度、 肾组织损害指数及肾功能情况与尿液中足细胞、 巨噬细胞数量的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 小鼠抗人PCX(podocalyxin)单克隆抗体(mAb)购自美国Cruze公司; CD68 mAb及异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗小鼠二抗购自北京中山生物技术有限公司; 荧光显微镜购自日本Nikon公司。大量蛋白尿（&>3.0 g/24 h）组27例， 男16例，女11例， 平均年龄34岁， 按肾活检结果分为lgA肾病16例， 过敏性紫癜肾炎2例， 膜增生性肾小球肾炎4例， 狼疮性并新月体形成3例， 急进性肾炎2例; 非大量蛋白尿（&<3.0 g/24 h）组19例， 男10例， 女9例， 按肾活检结果分为局灶性节段性硬化性肾炎6例， 膜性肾病8例， 微小病变性肾炎4例， 慢性间质性肾炎1例; 正常对照: 6例正常肾活检标本来自因组织配型不合不宜移植的供体肾， 20例正常血、 尿标本来自健康成人， 男8例， 女12例， 平均年龄35岁。
1.2 方法
1.2.1 尿细胞块制备及免疫组化 正常健康人和所有肾小球疾病患者行肾活检前1 d留取24 h尿液， 甲苯防腐， 离心机2000 r/min， 离心5 min， 倒去上清液把剩下的几滴液体倒入滤纸上， 摇动试管使尿沉渣散开， 滴加500 μL56℃溶化琼脂， 摇动试管使之充分混合直到琼脂变硬， 轻轻从试管取出琼脂状物，按常规组织病理学程序， 制成石腊细胞块，把细胞块切成3 μm切片， 60℃烘干1 h， 用含2 mL/L BSA的PBS浸泡2 min， 行抗PCX及抗CD68免疫组化染色， 操作参见文献［6-9］， 抗PCX识别足细胞， 抗CD68识别巨噬细胞。采用江苏省捷达科技发展公司的形态学图像分析系统， 对免疫组织化学阳性细胞进行相对含量测定， 计算每mm2蜡块阳性细胞数。
1.2.2 测定血Cr及尿Cr并计算肌酐清除率 测定尿蛋白含量， 单位用mg/L表示。均用化学法测定， 参见文献［10］。
1.2.3 肾检标本行HE染色及PAS染色 （1）计算肾小球横切面(gcs)细胞数并作半定量评分: 0分（正常&<60个细胞/gcs）， 1分（轻度增多60～90个细胞/gcs）， 2分（中度增多90～120 个细胞/gcs）， 3 分（重度增多&>120个细胞/gcs）; （2）计算肾皮质出现病理损害的肾小管百分数; (3)计算肾组织损害指数: 按下列指标: 肾小球细胞增多、 肾小球节段性坏死、 白金耳现象、 细胞性新月体、 核碎裂或苏木素小体、 血栓形成、 间质细胞浸润、 灶状出血。以上各项按缺如、 轻、 中、 重分别评为0、 1、 2、 3分， 相加得总分， 最高得分为24分。
1.2.4 统计学处理 计量资料用x±s表示， 组间差异比较用单因素方差 (oneway ANOVA)分析， 尿细胞块足细胞和巨噬细胞数量与肾组织损害指数相关分析用非参数spearman等级相关分析， 尿蛋白、 肌酐清除率与尿细胞块足细胞和巨噬细胞数量之间的比较用直线相关分析。
2 结果
2.1 尿细胞块足细胞和巨噬细胞免疫组化染色情况 尿细胞块抗PCX荧光免疫组织化学染色， 足细胞呈圆形或椭圆形， 整个细胞呈绿色， 强度+++， 碘化丙啶复染呈鲜红色， 圆形、 核大居中或偏一侧， 有时足细胞被包埋在管型之中(图1)。尿细胞块抗CD68染色， 巨噬细胞呈棕褐色， 着色于胞质(图2)。
图1 尿细胞块抗PCX荧光免疫组织化学染色(×400)（略）
图2 尿细胞块抗CD68免疫组织化学染色(×400)（略）
2.2 尿细胞块足细胞和巨噬细胞数量 肾小球疾病患者（大量蛋白尿组和非大量蛋白尿组）尿细胞块足细胞和巨噬细胞数量较正常对照明显增多。大量蛋白尿组和非大量蛋白尿组比较足细胞和巨噬细胞数明显增多（表1）。
表1 肾小球疾病患者尿蛋白与尿细胞块足细胞、 巨噬细胞之间的关系（略）
bP&<0.01 vs 正常对照组; dP&<0.01 vs 非大量蛋白尿组.
2.3 肾组织CD68表达及单核巨噬细胞浸润 正常肾组织仅有极少部分肾小球细胞和小部分肾小管细胞有弱的CD68表达， 巨噬细胞浸润极少并且仅有弱的CD68表达。而在肾小球疾病患者肾组织CD68表达及巨噬细胞浸润均显著增加。
2.4 相关分析 将46例患者的尿细胞块足细胞和巨噬细胞数量与其肾组织CD68表达、 巨噬细胞浸润、 肾组织损害指数、 Ccr分别进行相关分析， 结果示: 患者尿足细胞数量与肾组织损害指数(r=0.51， P&<0.01)， 肾小球及肾小管CD68(r=0.69、 0.31， P&<0.01、 0.05)、 蛋白尿程度(r=0.56， P&<0.01)及Ccr(r=0.67， P&<0.01)之间呈明显正相关。尿细胞块巨噬细胞数量与肾组织损害指数(r=0.47， P&<0.01)， 肾小球及肾小管CD68(r=0.58、 0.42， P&<0.01、 0.05)、 蛋白尿程度(r=0.38， P&<0.05)及Ccr(r=0.53， P&<0.01)之间呈明显正相关。尿蛋白、 血尿肌酐及肌酐清除率（表2）。
表2 肾小球疾病患者尿蛋白、 血尿Cr及Ccr（略）
3 讨论
细胞块作为细胞学诊断的重要辅助手段应用于胸腹水、 心包积液和穿刺液细胞学［11， 12］， 但应用于尿液未见报道。尿细胞块切片在不同程度上具有组织切片的特点， 且背景清晰， 除了在显微镜下观察形态学变化和定量以外， 另一方面可以做特殊染色、 免疫组织化学染色甚至荧光原位杂交， 而这些检测在普通尿沉渣涂片上进行是十分不方便的。更重要是细胞块具有细胞数量多， 易于保存， 长期不失效， 以便复查， 回顾性研究， 外院会诊，防止医疗纠纷等优点。我们的应用体会是: （1）加入琼脂不要超过60℃， 以免影响细胞的表面生物活性。（2）加入琼脂量应准确为200 μL， 尿液量准确必须充分离心， 残余上清液用滤纸拭去， 切片厚度应准确， 以免足细胞、 巨噬细胞定量不准确无可比性。有文献报道［13］介绍用流式细胞分析术检测尿巨噬细胞， 但是由于仪器试剂昂贵， 巨噬细胞较少且大量尿沉渣干扰， 尿细胞块检测足细胞、 巨噬细胞能定量且易在基层医院开展， 利用细胞块还能开展尿沉渣其他成分如管型和微生物的检测和保存。
肾小球疾病患者足细胞损伤可能与下列因素有关: 足细胞特异性表达蛋白nephrin、 podocin、 CD2相关蛋白表达和分布的改变， 转化生长因子β1诱导足细胞调亡， 足细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达增高， 血管紧张素Ⅱ改变足细胞在GBM上的运动， GBM被活性氧氧化损伤， 肾小球高滤过， 机械牵拉应力等［14］。足细胞在上述致损伤因素作用下从GBM脱落， 足细胞不可再生， 使肾小球内足细胞数目减少和（或）足细胞密度减少， 从而启动肾小球硬化进程。巨噬细胞在炎症的控制中占有主导作用， 在细胞因子网络中， 单核巨噬细胞能分化并表达不同功能， 最终引起组织损伤或修复。各种肾小球疾病肾组织伴有巨噬细胞明显浸润， 参与了肾小球炎症的发生和发展， 巨噬细胞可以通过产生活性氧基团（ROS）、 活性金属蛋白酶， 促进一氧化氮合成以及分泌细胞因子损伤肾小球基底膜和调节肾小球血流动力学［15］。从我们的研究来看: 肾小球疾病患者尿足细胞和巨噬细胞明显增高， 并且与蛋白尿程度、 肾组织损害指数及肾功能损害明显相关。与报道相一致。至于利用细胞块监测尿足细胞和巨噬细胞特异性蛋白表达和细胞调亡有待进一步研究。
综上所述， 肾小球疾病患者尿巨噬细胞和足细胞较正常人明显增高， 并在一定程度上反映了肾损害程度， 可考虑作为临床监测肾小球疾病的一个非创伤性指标， 并且有广阔的研究和发展空间。
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