作者：赵晖，邹海艳，徐萌，闫晓媛，薛璞
【摘要】 目的 观察竹节参总皂苷(total rhizoma panacis japonica saponins，tRPJS)对反复脑缺血再灌注小鼠及局灶性脑缺血再灌注大鼠海马组织一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的影响，探讨药物抗脑缺血损伤的作用机制。方法 插线法阻塞大脑中动脉(MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，采用反复夹闭双侧颈总动脉的方法造成小鼠脑缺血再灌注模型，研究tRPJS对这两种脑缺血再灌注损伤模型海马组织NOS、iNOS的影响。结果 tRPJS能显著降低脑缺血再灌注损伤小鼠和局灶性脑缺血大鼠海马组织NOS、iNOS的含量(P&<0.05)。结论 tRPJS抗脑缺血损伤与降低海马组织NOS、iNOS的活性有关。
【关键词】 竹节参总皂苷；脑缺血；一氧化氮合酶
Abstract：Objective To study the mechanism of protective effects of total rhizoma panacis japonica saponins (tRPJS) on the cerebral ischemia injury. Methods The middle cerebral artery occlusion model (MCAO) in rats and cerebral ischemia-reperfusion models in mice were used to investigate the influence of tRPJS on the nitric oxide synthase (NOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) activity in hippocampus region. Results tRPJS significantly decreased the contents of NOS and iNOS in hippocampus region of MCAO rat and cerebral ischemia reinfusion mouse. Conclusion tRPJS has significantly protective effects by decreasing NOS and iNOS.
Key words：total thizoma panacis japonica saponins；cerebral ischemia；nitric oxide synthase
大量研究表明，一氧化氮(NO)在急性脑缺血损伤中具有神经保护和神经毒性两种不同作用[1]。NO的双重作用除与自身复杂的理化、生物学特性有关外，一氧化氮合酶(NOS)作为NO合成过程中的重要限速酶，是决定其双重作用的关键因素。目前，诱导型NOS(iNOS)被认为是一种“病理型的酶”，在免疫刺激后表达，持续产生的NO与细胞毒作用有关[2]。海马是脑组织中对缺血、缺氧最敏感的区域之一，NOS及iNOS活力的变化与海马神经元的损伤具有相关性。通过检测反复脑缺血再灌注小鼠及局灶性脑缺血再灌注大鼠这两种脑缺血损伤模型的海马组织NOS及iNOS活力的变化，探讨竹节参总皂苷(total rhizoma panacis japonica saponins，tRPJS)抗脑缺血损伤的作用机理。
1 实验材料
1.1 动物
ICL雄性小鼠，清洁级，体重25～30 g，首都医科大学动物中心提供，合格证号：scxkc(京)72000-0012；SD雄性大鼠，清洁级，体重280～300 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK11-00-0008。
1.2 药物与试剂
tPRJS，首都医科大学中医药学院中药化学实验室提供，临用前以生理盐水稀释至所需浓度。NOS测定试剂盒、蛋白质测定试剂盒(考马斯亮兰法)均购自南京建成生物工程研究所。
1.3 仪器
752N型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产；TGL-16g型高速台式离心机，上海医用分析仪器厂生产；AEG-220电子分析天平，日本Shimadzu公司；DY89-1型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司。
2 实验方法
2.1 反复脑缺血再灌注小鼠模型的制备
小鼠麻醉，仰卧固定，颈正中切口，分离双侧颈总动脉及伴行神经，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，缺血20 min后松开双侧动脉夹，恢复脑血流20 min，如此反复操作3次，最后恢复供血，缝合皮肤。假手术组小鼠麻醉后，仅暴露双侧颈总动脉，不进行脑缺血再灌注。术中、术后室温控制在24～25 ℃。动物麻醉清醒后(术后约60 min)进行神经功能损害评分[3]，如分值在2分或2分以上则认为模型制作成功并纳入实验研究。
2.2 局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的制备
参照Koizumi法[4]制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。大鼠麻醉，仰卧固定，颈正中切口，依次暴露右侧颈总、颈外和颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将预先用酒精灯烧成圆头的尼龙线(长4 cm，直径0.25 mm)置于颈内动脉17～18 mm，到有轻微阻力感为止，扎紧动脉残端，缝合皮肤，缺血2 h后，将尼龙线轻轻拨出再灌。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分支，不闭塞大脑中动脉。术中、术后室温严格控制在24～25 ℃，大鼠体温维持在36.5～37.5 ℃。采用Bederson等[5]介绍的神经功能评分法对麻醉清醒后(术后约70 min)的大鼠进行评分，如分值在2分或2分以上则认为模型制作成功并纳入实验研究。
2.3 分组及给药
反复脑缺血再灌小鼠模型制备成功后，将实验动物随机分为5组，即假手术对照组、模型组及tRPJS组(260、130、65 mg/kg)。用药组先腹腔注射给药2 d，第3天给药后20 min施行手术，术后每8 h给药1次。假手术对照组、模型组腹腔注射等量的生理盐水。局灶性脑缺血再灌大鼠模型制备完成后，将实验动物随机分为5组，即假手术对照组、模型组及tRPJS组(200、100、50 mg/kg)。用药组先腹腔注射给药2 d，第3 d给药后20 min施行手术，术后每8 h给药1次。假手术对照组、模型组腹腔注射等量的生理盐水。
2.4 脑组织匀浆的制备
反复脑缺血再灌小鼠术后24 h断头处死，迅速放入冰盒中分离各组小鼠的海马组织。局灶性脑缺血再灌大鼠再灌22 h后断头处死，在冰浴中分离大鼠缺血侧海马(右侧)。分离后的海马组织均称重后放入预冰的生理盐水中，冰浴中制成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清。按NOS及蛋白质测定试剂盒说明书分别进行测定。
2.5 统计学方法
实验数据以x±s表示，均使用SPSS 10.0统计软件，进行方差分析。
3 结果
(见表1、表2)表1 tRPJS对反复脑缺血再灌注小鼠海马组织NOS、iNOS含量的影响(略)注：与假手术组比较，*P&<0.05；与模型组比较，#P&<0.05(下同)。表2 tRPJS对局灶性脑缺血大鼠海马组织NOS、iNOS的影响(略)
4 讨论
NO作为信使分子对脑缺血疾病的作用研究已相当广泛，在脑缺血早期短暂的NO增高，可以通过扩张血管维持脑血流，防止血小板和白细胞的聚集与粘附及下调N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体而起到神经保护作用。但在脑缺血亚急性期，随着NO的大量产生，缺血脑组织通过NMDA受体介导谷氨酸神经毒性作用，发挥NO的细胞毒作用[6]。正是由于NO作用的双重性，研究脑缺血过程中不同功能的NOS及其产物NO的作用将有助于临床脑缺血损伤的治疗。目前比较一致的看法是，缺血早期NO主要由原生型NOS(cNOS)合成，它对维持血管内皮功能、抗白细胞粘附和维持脑微循环通畅有益，过早抑制cNOS合成NO可加重缺血性脑损伤；脑缺血和(或)再灌注12 h～4 d时脑组织NO主要由诱生型(iNOS)合成，由iNOS所产生的NO可能直接或者通过其衍生物导致能量耗竭，促进DNA的损害，抑制DNA的合成，诱导细胞程序性死亡，增加缺血后兴奋性神经递质的释放而加重缺血性损害，应用iNOS抑制剂可明显减轻脑损伤。本实验观察到，反复脑缺血再灌小鼠及局灶性脑缺血再灌大鼠在缺血损伤24 h后，海马组织NOS明显升高，特别是iNOS与假手术组相比升高显著。这就进一步证实iNOS的活性增高、NO的过度生成与缺血性损伤有密切关系。tRPJS是从五加科植物竹节参Panax Japonicus C.A Meyer根茎中提取的主要有效活性部位，其主要成分包括竹节人参皂苷(chikusetsu- sapnin)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，人参皂苷(ginsenoside) Rd、Re、Rg1、Rg2 ，三七皂苷R2(notoginsenosideR2)。本室前期的药理实验证明，tRPJS对脑缺血动物模型有很好的保护作用，利用反复脑缺血再灌注小鼠及局灶性脑缺血再灌大鼠这两种脑缺血损伤模型，我们发现，tRPJS能明显降低脑缺血损伤动物海马组织NOS、iNOS的活性(P&<0.05)，表明tRPJS保护脑缺血损伤的机理与阻抑NOS、iNOS的过度表达有关。
【参考文献
】
[1] 陈 琳，高 署，胡成穆，等.一氧化氮及一氧化氮合酶在脑缺血损伤中的作用[J].安徽医药，2004，2(8)：5.
[2] Dawso VL，Dawson TM，Batley DA，et al. Mechanism of nitric oxide mediated neurotoxity in primarty brain cultures[J].Neurosic，1993，13(6)：2651－2661.
[3] 翁鸿博，马 涛.葛根黄苷元对脑缺血的保护作用及机理探讨[J].中国药理学通报，1999，15(6)：534－536.
[4] KoizumiJ，Yoshida Y，Nakaazawa T，et al.Experimental studies of ischemic brain edemata new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Stroke，1986，8：1－8.
[5] Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stoke，1986，17：472－476.
[6] Dawson VL，Dawson TM，London ED，et al.Nitric oxide mediates glutamate neuroxicity in primaty cortical culture[J].Proc Natl Acad Science USA，1991，88(14)：6368－6377.