作者：李泽庚，童佳兵，彭波，张念志，郑汉城，季红燕
【摘要】 目的 利用基因芯片研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)肺气虚证和肺阴虚证患者T淋巴细胞基因表达的差异。方法 采集肺气虚证、肺阴虚证患者和健康人的外周血作为实验血样和对照血样。用Ficoll技术分离外周血淋巴细胞，用分选式流式细胞仪分选并纯化T淋巴细胞，并采用一步法提取总RNA，逆转录合成双链cDNA后，体外转录合成生物素标记的cRNA，片断化后，采用人类全基因表达谱芯片进行芯片杂交，扫描后筛选出差异表达基因。结果 肺气虚证患者/健康人外周血T淋巴细胞相关差异表达基因45条，其中上调41条，下调4条；肺阴虚证患者外周血T淋巴细胞相关差异表达基因32条，其中上调19条，下调13条；肺气虚证组/健康人组和肺阴虚证组/健康人组均高表达的差异基因5条。结论 基因芯片技术能有效地研究基因的表达谱，筛查出COPD肺气虚证、肺阴虚证患者T淋巴细胞相关差异基因。
【关键词】 慢性阻塞性肺疾病；肺气虚证；肺阴虚证；T淋巴细胞；基因表达；基因芯片
Abstract：Objective To study the associated gene expression in thymus-dependent lymopholyte of the COPD patients with pulmonary qi deficiency syndrome (PQDS) and pulmonary yin deficiency syndrome (PYDS) by gene chips. Methods Collect peripheral blood of patients with PQDS and PYDS (as experimental samples) and of nomal man (as control samples). By Ficoll method， peripheral blood lymphocyte was collected， then thymus-dependent lymphocyte were extracted and purified by flow cytometry. Total RNA were extracted by one-step technique and purified. Then， synthesis double strand cDNA template from total RNA， transcription of cRNA probe with biotin labeling， subsequently， cRNA sample were fragmented. The gene chip (Human Genome U133 Plus 2.0 Array， 38500 genes) was hybridized and scanned. Then fluorescent signal value of gene expressing was obtained， and differential expression genes were sifted. Results There were 45 genes expressed differently among PQDS and normal man， including up-regulated 41 and down-regulated 4；32 genes expressed differently between PYDS and normal man， including up-regulated 19 and down-regulated 13；5 up-regulated genes expressed differently between PQDS and PYDS with normal man. Conclusion Gene chip can be applied to study gene expression profiles effectively and to screen PQDS and PYDS associated genes.
Key words：chronic obstructive pulmonary disease；pulmonary qi deficiency syndrome；pulmonary yin deficiency syndrome；thymus-dependent lymphocyte；gene expression；gene chip
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种具有气流受限特征的肺部疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展。肺气虚证是以肺功能减退为主要特征的全身多系统、多脏器功能障碍的综合征，肺气虚证可进一步发展为肺阴虚证并直接影响COPD的发生和发展，且贯穿于COPD的整个病程之中。肺气虚证和肺阴虚证能比较集中反映“肺”的各种生理功能不足表现的综合证候群，继往研究证实肺气虚证和肺阴虚证都存在T淋巴细胞免疫功能下降[1]。为明确COPD肺气虚证和肺阴虚证的T淋巴细胞相关基因的变化，本课题通过基因芯片技术对其基因表达差异进行分析和对比研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂
CD3抗体(FITC Conjugate Caltag laboratories)；淋巴细胞分离液(Cedarlane Laboratories Ltd.，比重1.077±0.001)；TRIzol Reagent(Invitrogen Life Technologies)。
1.1.2 芯片
Affymetrix人类全基因组表达谱芯片(Human Genome U133 Plus 2.0 Array)和质控芯片(TEST3)。
1.1.3 主要仪器
流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；Affymetrix Hybridization Oven 640；Affymetrix GeneChip Scanner 3000。
1.2 方法
1.2.1 标本来源
实验组：选择肺气虚证(符合《中药新药临床研究指导原则》[2]肺气虚证诊断标准)患者4例，男性，年龄40～50岁，平均(45.3±4.5)岁，病程6～15年，平均(10±3.2)年；对照组：肺阴虚证(符合《中医诊断学》[3]中肺阴虚证标准)患者4例，男性，年龄43～55岁，平均(46.7±3.2)岁，病程9～17年，平均(12±5.9)年。西医确诊为COPD[4]。所有患者均经安徽中医学院第一附属医院名医堂主任医师逐一辨证审核。4名健康查体者为健康对照组，男性，年龄40～50岁，平均(42±1.2)岁，所选患者与健康者无血缘关系。
1.2.2 标本采集与T淋巴细胞分选
按病例编号，每组患者各采取外周静脉血10 mL，EDTA抗凝，均分成3管，用等量无RNA酶的PBS稀释后，在无菌条件下采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核淋巴细胞(严格按说明书操作)，回收细胞，立即加入CD3抗体，闭光保存10 min，采用分选式流式细胞仪进行T淋巴细胞分离。
1.2.3 总RNA提取、纯化
用TRIzo提取总RNA(严格按说明书操作)。用紫外分光光度计定量和检测RNA的纯度，将处理好的RNA样品，稍微离心，70 V恒压电泳1 h，在凝胶成像仪上观察结果，并将纯化后的总RNA进行定量和检测。
1.2.4 基因芯片探针制备
取正常人、肺气虚组和肺阴虚组T淋巴细胞总RNA(分别取每组4例T淋巴细胞RNA等量混合而成)各10 μg，用T7-oligo dT引物合成cDNA，纯化后体外转录合成cRNA的同时用生物素标记，纯化和质控cRNA，片断化cRNA探针。
1.2.5 杂交和洗涤
先进行质控芯片杂交、洗染和分析，根据测试芯片的结果，在芯片杂交仪杂交表达谱芯片，在洗脱工作站上按照芯片类型运行洗脱程序。
1.2.6 荧光扫描和结果分析
用生物芯片扫描仪扫描芯片，得到data图像文件，提取基因表达的荧光信号强度值。用预先选定的内参照基因(100个管家基因)对原始提取信号进行标准化。应用GCOS (Affymetrix Genechip Operating Software) 1.2软件进行数据统计分析和GeneSpring 7.2软件及Affymetrix Netaffx Analysis Center将基因按基因功能(Molecular Function)进行分类。
1.2.7 筛选差异表达基因的标准
①信号值(Scaling Signal)其中之一必须&>600或两者均&>200；②信号值比&>2为高表达基因[信号值对数比(Signal Log Ratio(SLR)&>1]，信号值比&<0.5为低表达基因(SLR&<-1)；③实验组和对照组均为表达(p-value&<0.04)。
2 结果
2.1 总RNA抽提结果
从T淋巴细胞中提取的总RNA，电泳质检显示18S和28S条带清晰，正常人组、肺气虚组和肺阴虚组的OD260和OD280吸光度比值均在2.0附近，证实已抽提出高纯度的总RNA。
2.2 肺气虚证/健康人T淋巴细胞的基因表达谱
在肺气虚证/正常人T淋巴细胞中，共发现上调基因1 407条，下调基因825条，筛选出45条差异表达基因，其中41条基因在肺气虚证患者T淋巴细胞中表达显著上调；4条基因表达显著下调，其分布在远离散点图对角线的位点上。见图1。表1 肺气虚证组、肺阴虚证组VS健康人组均高表达的差异基因(略)
2.3 肺阴虚证/健康人T淋巴细胞基因表达谱
在肺阴虚证/健康人T淋巴细胞中，共发现上调基因913条，下调基因1 347条，筛选出32条差异表达基因，其中19条基因在肺阴虚证T淋巴细胞中表达显著上调；13条基因表达显著下调。见图2。
3 讨论
中医“证”是中医临床诊断和治疗的核心，但“证”的本质研究一直难以有重大进展，主要因为中医理论涉及到生命的整体，因而牵涉到许多基因和蛋白质。基因芯片技术是20世纪90年代兴起的一项前沿生物技术，是一种系统、整体的研究方法，整体宏观地研究生物体基因的表达及功能。本课题利用基因芯片技术和聚类分析原理，通过检测肺气虚证、肺阴虚证患者和正常人外周血T淋巴细胞相关基因的表达，建立了肺气虚证与肺阴虚证的相关基因表达谱。
将肺气虚组、肺阴虚组、健康人组每组4例T淋巴细胞RNA分别等量混合而成总RNA，经体外转录合成cRNA的基因表达列为每组的基因表达谱并建立数据库，将肺气虚证组/健康人组和肺阴虚证/健康人有共同差异者选为COPD肺气虚证和肺阴虚证的相关差异表达基因。通过筛选3组芯片38500条靶基因得出，COPD肺气虚证与肺阴虚证的T淋巴细胞相关差异表达基因主要为免疫蛋白相关基因、酶相关基因、运输相关基因等。
通过2组对比研究发现：PF4、IGKC、DEFA1、GNLY、 HLA等基因表达有显著差异，其中PF4基因表达下调，IGKC、DEFA1、GNLY基因表达上调。其中PF4表达下调，可致体液免疫功能降低，而DEFA1、GNLY两个基因表达上调则可刺激T淋巴细胞的活化；IGKC基因上调，又能够促进B细胞活化，增强免疫球蛋白功能，提示肺气虚证与肺阴虚证两种病理过程中同时存在免疫系统功能异常为主。因此可以表明，尽管肺气虚证与肺阴虚证两类患者T淋巴细胞相关差异表达基因的变化有很大不同，反映了这两种病证类型存在本质的差异，但同时它们之间也存在一定的相似性，有着共同的基因表达谱改变。
人类白细胞抗原(HLA)为目前已知的最复杂的人类基因复合体，本课题在肺气虚证组、肺阴虚证组分别发现HLA-DQB1和HLA-DRB4两条基因，其高表达导致异常免疫应答， 使维持机体内环境稳定的T淋巴细胞各亚群的比例失调，进而导致CD4调节的B淋巴细胞成熟、分化的过程发生障碍，从而导致对外感疾病的抵抗能力减弱，增加了对外感疾病的易感性[5]。
《素问五脏生成》曰：“肺主一身之气”，“诸气者，皆属于肺”，肺气盛衰直接影响机体防御功能。中医肺卫功能与现代医学免疫反应的屏障作用是甚为近似。卫外功能有着抵御外邪、预防外感疾病发生的重要作用[6]。COPD的发病也必然与机体正气虚损有关，肺气虚是COPD发生发展的内在条件和首要条件，当COPD持续发展时，由于脾肾功能受损，又会进一步加重肺气虚，从而影响肺主呼吸、主治节功能。因此，田氏等[7]提出，肺气虚直接影响COPD的发生和发展，其盛衰与COPD病情轻重一致，且贯穿于COPD的整个病程之中。我们的既往研究[1]表明，肺气虚证和肺阴虚证CD3+淋巴细胞水平降低，而肺阴虚证更为明显，但都表现为其淋巴细胞免疫功能低下而易于发病的特征。
从现代医学角度来看，中医肺气虚相当于心肺功能低下，属组织易于缺氧或组织能量易于耗竭的状态[7]。肺气虚证与肺阴虚证是COPD及其合并症中常见的证型。本课题所选病例都有不同程度的低氧血症。在肺气虚证组/健康人组和肺阴虚证组/健康人组均高表达的5条差异基因中(见表1)，与氧的运输(或血红蛋白结合)有关的3条基因为HBB、HBA1、HBA2。其异常表达可能导致氧运输障碍，由此从基因分子水平初步揭示了COPD肺气虚证和肺阴虚证患者的咳喘气短、呼吸困难等症状的物质基础和科学内涵。
综上所述，本课题从基因分子水平探讨了COPD肺气虚证与肺阴虚证患者T淋巴细胞相关基因的表达及变化在其发病中的作用，探讨了肺气虚证与肺阴虚证的本质，初步揭示了COPD患者低氧血症的分子水平物质基础。研究表明，肺气虚证和肺阴虚证实质涉及T细胞的基因表达谱改变[8]。同时表明肺气虚证与肺阴虚证患者外周血T细胞相关基因表达谱有着共同改变，两证具有相对独立的共性的免疫学机制和证候间内在的联系，两证的发生有其免疫相关基因组学基础，是诸多免疫相关基因异常表达的综合结果。但由于该研究仅初步筛选了COPD肺气虚证与肺阴虚证T细胞相关基因组学改变的异常表达基因，所得结果是否具有广泛的特异性，尚需今后进一步研究方能确定其在分子水平的金指标。
参考文献
[1] 李泽庚，张杰根，彭 波.肺气虚证和肺阴虚证患者外周血Ｔ细胞的变化[J].中国中医药科技，2006，13(1)：65.
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