【摘要】 目的 观察痛必定注射液对坐骨神经结扎性慢性损伤模型(CCI)大鼠脊髓N-甲基-D-天冬氨酸受体1(NR1)的影响。方法 雄性SD大鼠30只，随机分为正常组、CCI组和痛必定组。采用RT-PCR技术测定各组大鼠脊髓内NR1表达的变化。结果 CCI组较正常组脊髓内NR1 mRNA表达量明显升高(P&<0.001)；CCI＋痛必定组NR1 mRNA表达受到明显抑制(P&<0.001)。结论 痛必定注射液在脊髓水平的镇痛机理与其抑制NR1 mRNA的表达有关。
【关键词】 痛必定注射液；N-甲基-D-天冬氨酸受体1；RT-PCR；动物模型
Abstract：Objective To study the effect of Tongbiding injection on expression of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor 1 mRNA in the spinal cord of chronic constriction injury (CCI) rats. Methods Thirty male Spragru-Dawley rats were randomly pided into control group (group A)， CCI group (group B) and Tongbiding group (group C)， ten rat for eah group. The changes in NR1 mRNA expression in the spinal cord was detected by reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR) techniques. Results The expression of NR1 mRNA in the spinal cord was minimal in control group， CCI induced significant increase in the expression of NR1 mRNA in the spinal cord and Tongbiding significantly inhibited the increase in NR1 mRNA expression. There was significant difference between CCI and Tongbiding group (P&<0.001). Conclusions Inhibition NR1 mRNA expression in the CCI rats spinal cord may contribute to analgesic mechanisms of Tongbiding in the spinal dorsal horn.
Key words：Tongbiding injection；NR1 mRNA；RT-PCR；animal model
痛必定注射液由4种中药(有效成分或部位)组成，其动物实验和临床应用均显示和杜冷丁[1-2]有相似的镇痛效果，但无明显成瘾性，其镇痛作用产生的机理尚未完全清楚。谷氨酸/天冬氨酸受体是中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质/受体系统，它参与了机体多种生理和病理过程，如学习记忆、神经元可塑性变化等。研究认为，天冬氨酸受体在神经源性疼痛的产生和维持中起关键作用[3]。本实验采用RT-PCR技术观察痛必定注射液对于坐骨神经结扎性慢性损伤模型(CCI)大鼠脊髓N-甲基-D-天冬氨酸受体1(NR1 mRNA)表达变化的影响，探讨其镇痛机理。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
雄性Wistar大鼠30只，体重(200±20)g[吉林大学实验动物中心提供，合格证号SCXK-(吉)2003-0001]。随机分为正常组(A组)、CCI造模组(B组)、痛必定组(C组)3组。将B组和C组大鼠在无菌条件下1%异戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉。暴露左侧的坐骨神经干，在中部4～5 mm范围内，用4-0号铬制羊肠线打3～4个结，以引起小腿微微抽动为宜，然后逐层缝合；另一侧行假手术。14 d后用特制大鼠固定笼固定大鼠，以SH-XYT型小型动物压痛仪(深圳凯强利股份有限公司)分别测量双侧后肢的痛阈值，左侧痛阈显著降低，并结合行为学改变，认为造模成功。C组按20 mg/kg体重剂量连续5 d腹腔注射痛必定注射液，A、B组同时给予同剂量生理盐水。
1.2 药物和试剂
痛必定注射液由长春中医药大学药理实验室提供，批号20050609。RNA裂解液(上海华美生物工程公司)；总RNA提取试剂盒和RNA逆转录试剂盒；PCR Marker(华美公司产品)；Takara试剂盒(大连宝生物公司)；Primer由奥科生物工程公司合成。
1.3 取材
1%异戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，快速取出腰段脊髓，放入液氮内保存；取材结束后，将标本放入-80 ℃冰箱待用。
1.4 引物设计
NRl-F：5’-GTCGGTATCAGGAATGCG-3’，NRl-R：5’-GGTGCT CGTGTCTTGGA-3’，扩增片段长度330 bp；β-action-F：5’-GATTGCCTCAGGACATITCTG-3’，β-action-R：5’-GATTGCTCAG GACATTCTG-3’，扩增片段长度620 bp。
1.5 实验步骤
提取RNA：组织0.1 g，剪碎研磨＋RNA裂解液1 mL，加200 μL氯仿混匀，13 000 r/min、4 ℃离心15 min，吸上清＋500 μL异丙醇，4 ℃放置30～60 min，13 000 r/min、4 ℃离心15 min，弃上清，沉淀＋1 mL 70%酒精漂洗1次， 13 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀加dd.h3O 50 μL。逆转录合成cDNA：取2 μL RNA 65 ℃变性3 min，加入反应缓冲液，总体积为20 μL，42 ℃反应60 min，95 ℃ 5 min，终止反应，加水稀释至l00 μL。PCR扩增产物分析：取10 μL PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙啶染色后，紫外灯下观察RT-PCR扩增产物。
1.6 统计学方法
采用SPSS 9.0软件进行统计学处理；组内比较用t检验；组间比较用单因素方差分析，并以q检验比较两两差异。
2 结果
经RT-PCR扩增后获得受体NR1、β-action带，凝胶图像分析仪分析电泳结果，计算NR1与β-action比值。B组NR1 mRNA表达明显高于其它各组(P&<0.01，t＝11.853)，C组NR1 mRNA的表达受到了明显抑制(P&<0.01，t＝7.641)，见图l。
3 讨论
NMDA受体是哺乳动物中枢神经系统主要的兴奋性氨基酸受体之一，在中枢神经许多重要的生理和病理过程中起关键作用[4]。NMDA受体是由3个NMDA1和2个NMDA2亚基组成的异五聚体[5]。NR1是天冬氨酸受体通道活性所必须的，而NR2具有调节通道活性的作用。在脊髓水平的痛觉调制中，谷氨酸的NMDA受体已证明在慢性疼痛的诱导和维持中起关键作用[6]。外周组织损伤或炎症反应，通过激活Aβ纤维和C纤维在脊髓背角大量释放谷氨酸，激活NMDA受体，促使其基因表达增加。在神经损伤时早期采取相应措施，减少NMDA受体激活，可减轻持续性疼痛。
本实验研究表明，痛必定注射液可以明显抑制CCI模型大鼠脊髓水平NR1 mRNA的表达。提示痛必定注射液的镇痛机制可能是通过拮抗NMDA受体/通道，抑制细胞内一系列级联反应而实现的。
参考文献
[1] 王冰梅，侯 宜，许 侃.痛必定注射液镇痛作用机理的初步研究[J].吉林中医药，2002，22(4)：51－52.
[2] 曹 军.痛必定粉针对大鼠脊髓背角广动力范围神经元电活动的影响[J].吉林中医药，2004，24(6)：54.
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[4] Ozawa S，Kamiya H，Tsuzuki K，et al.Glutamate receptors in the mammalian central nervous system[J].Prog Neurobiol，1998，54：581－618.
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[6] Wang H，hang RX，Wang R，et al.Decreased expression of N-methyl- D-aspartate(NMDA) receptors in rat dorsal root ganglion following complete Freund’s adjuvant-induced inflammation：an immunoeytochemical study for NMDA subunit[J]. Neuroscience Letters，1999，265：195－198.