【摘要】 目的 观察天麻多糖(GEP)-2对小鼠四氯化碳(CCl4)肝损伤和酒精肝损伤的影响。方法 分别采用CCl4和北京红星二锅头诱导小鼠肝损伤，比色法测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)以及酒精肝损伤中三酰甘油(TG)的含量、肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)浓度，并作肝组织切片病理观察。结果 GEP-2(25、50、100 mg/kg)给药明显降低小鼠血清中升高的ALT和AST水平及酒精性肝损伤中TG含量，抑制肝脏中上升的MDA水平和提高过低的SOD活性。病理检查结果显示GEP-2有明显的保肝作用。结论 GEP-2对小鼠CCl4肝损伤和酒精肝损伤均具有显著的保护作用。
【关键词】 天麻多糖；小鼠；四氯化碳；酒精性肝损伤
Abstract：Objective To observe the protection effect of Polysaccharide GEP-2 from Gastrodia elata on carbon tetrachloride (CCl4) and alcoholic liver injury in mice. Methods CCl4 and alcohol were adopted to establish CCl4 and alcoholic liver injury model in mice respectively. Colorimetric method was used to assay the content of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST)， and the content of triglyceride (TG) in alcoholic liver injury， the activity of superoxide dismutase (SOD) and malondiadehyde (MDA) consistent of liver homogenate in mice， and observe liver tissue pathological section. Results Polysaccharide GEP-2 from Gastrodia elata (25， 50， 100 mg/kg) administration obviously reduced the high level of ALT and AST in serum and the content of TG in alcoholic liver injury， inhibit the high level of MDA and increase the low activity of SOD in liver homogenate. Patholory inspection result indicated that Polysaccharide GEP-2 from Gastrodia elata exert notable influence on CCl4 and alcoholic liver injury in mice. Conclusion Polysaccharide GEP-2 from Gastrodia elata has apparently protective effects on CCl4 and alcoholic induced liver injury in mice.
Key words：Gastrodia elata Polysaccharide；mice；carbon tetrachloride；alcoholic liver injury
天麻具有平肝熄风、通络止痛之功效，临床上用于治疗头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫抽搐、高血压、破伤风症等。《中华人民共和国药典》[1]及许多现代天麻产品标准皆以天麻素含量作为质量指标，认为天麻的主要成分为天麻素，而对天麻多糖(GEP)这一生物大分子的功效研究甚少。我们在天麻的研究中提取、纯化出GEP-1、GEP-2、GEP-3三种多糖组分，分别进行了保肝作用研究，结果发现GEP-2保肝效果优于GEP-1、GEP-3，且保肝作用十分显著。现就GEP-2的保肝作用研究报道如下。
1 实验材料
1.1 试剂与药物
GEP-2(多糖含量96%)：本实验室自制。四氯化碳(CCl4)：安徽宿州化学试剂厂(批号041611)。红星二锅头：北京红星股份有限公司(批号10781289)。联苯双酯：浙江万邦药业有限公司(批号050808)。三普解郁肝舒胶囊：三普药业股份有限公司(批号041212)。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测试盒：上海荣盛生物技术有限公司(批号20060228/20060108)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测试盒：南京建成生物工程研究所(批号20060421/ 20060424)。三酰甘油(TG)测试盒：北京市福瑞生物工程公司(批号060425)。
1.2 动物
昆明种健康小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，安徽医学研究所动物实验中心提供(皖医动准字第03号)。
1.3 仪器
UV-9200紫外可见分光光度计，Pharmacia产品。DK-8D型电热恒温水浴槽，上海精宏实验设备有限公司产品。BS224S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。TL-16R台式高速冷冻离心机，上海市离心机械研究所产品。ALphaL-2冷冻干
燥机，德国Christ公司。AKTA快速分离纯化系统，Pharmacia产品。BX51 Olympus荧光显微系统，日本。
2 实验方法
2.1 天麻多糖-2对四氯化碳诱导小鼠肝损伤的作用[2]
小鼠正常饲养2 d，随机分成正常对照组、CCl4模型组、联苯双酯(100 mg/kg)阳性对照组及GEP-2低(25 mg/kg)、中(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量组，每组10只动物。正常对照组ig 0.4 mL/d生理盐水，CCl4模型组ig 0.4 mL/d CCl4(CCl4浓度2.5 mg/mL)，其它实验组小鼠ig相应剂量药物＋0.4 mL/d CCl4 ，共5 d(实验动物饲养设施合格证号：皖医动准字第02号，下同)。末次给药后禁食16 h，称重，摘除眼球取血，分离血清，测定ALT、AST；同时，脱颈椎处死小鼠，立即破腹取肝脏，用4 ℃生理盐水冲尽残血，滤纸拭干，称重，计算肝脏指数；取肝脏左叶相同部位，1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，HE染色，作病理检查；取肝脏右叶用冷生理盐水制备5%肝匀浆，测定MDA和SOD含量。
2.2 天麻多糖-2对红星二锅头诱导的小鼠酒精肝损伤的作用[3]
小鼠正常饲养2 d，随机分成正常对照组、酒精模型组(0.25 mL红星二锅头)、三普解郁肝舒胶囊(800 mg/kg)阳性对照组及GEP-2低(25 mg/kg)、中 (50 mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量组，每组10只。正常对照组ig 0.4 mL/d生理盐水，酒精模型组ig 0.25 mL/d红星二锅头，其它实验组小鼠ig 相应剂量药物＋0.25 mL/d红星二锅头，共10 d。末次给药后禁食16 h，称重，摘除眼球取血，分离血清，测定ALT、AST、TG；以下操作同“2.1”项。
2.3 肝细胞坏死程度分析方法
肝细胞坏死程度可分为4级[4]：0级，没有肝坏死；1级，轻度肝坏死；2级，中度肝坏死；3级，严重肝坏死。依此累计每组动物肝坏死级数，计算其平均肝坏死级数与标准差。
2.4 统计学方法
数据应用SPSS 10.0软件包进行处理。各项数据以x±s表示，用方差分析及t检验比较组间差异的显著性。
3 结果
3.1 天麻多糖-2对四氯化碳肝损伤小鼠血清转氨酶和肝脏超氧化物歧化酶、丙二醛及肝脏指数的影响(见表1)表1 GEP-2对CCl4诱导小鼠肝损伤的保护作用(略)注：与正常对照组比较，**P&<0.01；与模型组比较，▲P&<0.05，▲▲P&<0.01(下同)。
3.2 天麻多糖-2对酒精肝损伤小鼠血清转氨酶、三酰甘油和肝脏超氧化物歧化酶、丙二醛及肝脏指数的影响(见表2)表2 GEP-2对红星二锅头诱导小鼠酒精肝损伤的保护作用(略)
3.3 病理检查结果
2组实验中正常对照组小鼠肝组织结构完整；CCl4和酒精肝损伤模型组肝细胞排列紊乱，肿胀及气球样变，肝中央静脉周围有大范围的肝细胞变性坏死，细胞核明显大小不等，呈不同程度的固缩，坏死灶分布于肝小叶中央静脉周围和肝被膜下，小叶内可见灶性坏死区，坏死区内有较多淋巴细胞和浆细胞浸润，汇管区内有单核细胞浸润。与模型组比较，GEP-2低、中、高剂量组肝细胞病变明显减轻，坏死灶明显减少，偶见散在点状分布，坏死区内受损肝细胞较模型组明显减少，随GEP-2剂量的增大，对肝细胞的保护作用也随之增强，高剂量组小鼠肝损伤程度明显减轻。阳性对照药联苯双酯和三普解郁肝舒胶囊也有一定保肝作用。按肝细胞坏死程度分析方法可看出：正常对照组没有肝坏死(0级)；模型组接近严重肝坏死(3级)；GEP-2低、中剂量组分别介于中度肝坏死左右(2级)；GEP-2高剂量组与阳性对照组仅见轻度肝坏死(1级)。结果见表3。表3 GEP-2对CCl4和红星二锅头诱导小鼠肝细胞坏死的作用(略)
4 讨论
实验结果表明，GEP-2低、中、高剂量对CCl4和红星二锅头致小鼠肝损伤均具有明显保护作用，且存在剂量依赖关系。表1和表3显著性分析可看出，GEP-2中剂量(50 mg/kg)与阳性对照药联苯双酯(100 mg/kg)和三普解郁肝舒胶囊(800 mg/kg)对小鼠两种肝损伤的保护作用相当，GEP-2高剂量(100 mg/kg)效果优于阳性对照药物。GEP-2与阳性药物的保肝效果差异可能与它们的作用机理不同有关，有待深入研究。
CCl4和酒精均可使小鼠体内产生大量的自由基，而肝脏极易受到自由基的侵害而发病，造成肝损伤。实验结果显示，GEP-2明显升高肝脏中降低的SOD活力，降低升高的MDA水平，表明GEP-2可提高机体超氧化物歧化酶活力，清除体内CCl4和酒精代谢产生的自由基，减少脂质过氧化产物的生成，具有很强的抗脂质过氧化功能。另外，GEP-2可使CCl4和红星二锅头诱导的肝损伤小鼠血清ALT、AST、TG升高的水平降低，表明GEP-2对细胞膜的完整性也具有很好的保护作用。表明GEP具有潜在的开发价值，至于其确切保肝作用机制有待进一步深入研究。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2000.44.
[2] 孙步祥，周 炯.四氯化碳中毒性肝损伤诊断指标探讨[J].职业医学， 1991，18：263－266.
[3] 金 政，朴丽花.悦肝胶囊对酒精中毒小鼠肝脏保护作用的实验研究[J].山东中医杂志，2004，24(9)：551.
[4] Wang GS，Liu GT.Role of nitric oxide in immunological liver damage in mice[J].Biochem Phamacol，1995，49(2)：1277－1281.