作者：冯淬灵，金 焱，武红莉，武维屏
【摘要】 目的 建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型，观察益气活血化痰中药复方对其肺组织形态学的影响。方法 采用气管内注入内毒素和烟熏的复合法建立COPD模型，分别于造模开始第20、30、40天给予益气活血化痰中药复方和罗红霉素干预(各组分别简称h 20、h 30、h 40、r 20、r 30、r 40)，通过胶原特殊染色及图像分析法观察干预因素对肺组织形态学的影响。结果 结合病理及肺功能检查结果，模型符合人类COPD特点。HE染色显示药物干预组气道壁炎症及上皮层改变较模型组有不同程度的减轻。天狼星红染色显示模型组胶原纤维较对照组增多，用药组较模型组减少。模型组管壁较正常对照组显著增厚(P&<0.01)；h 20、h 30组与r 20、r 34(r 30合r 40)组比较，管壁厚度均较模型组显著减小(P&<0.05)。模型组胶原层较对照组显著增厚(P&<0.01)；h 20、h 30、h 40及r 20组小气道胶原层厚度均较模型组减小(P&<0.05)。结论 益气活血化痰方可能通过抑制以胶原为主的细胞外基质过度沉积，从而干预COPD气道重塑，延缓气流受限进程。
【关键词】 益气活血化痰方；慢性阻塞性肺疾病；动物模型
Abstract：Objective To establish chronic obstructive pulmonary disease (COPD) rat models， and to study the intervention of the formula of nourishing Qi， activating blood circulation and dispersing phlegm recipe on the morphology. Method To establish rat COPD models by intratracheal instillation of lipopolysaccharide and exposure to cigarette smoke. To instill intervention drug daily either the formula of nourishing Qi， activating blood circulation and dispersing phlegm recipe or the roxithromythin， starting on the 20th， 30th and 40th day of the experiment respectively (the groups was named h 20， h 30， h 40， r 20， r 30 and r 40 for short)， and to observe the effect on the morphology by means of collagen staining and image analyzer. Results The pathological changes and lung function in the model group were accorded with the human COPD. In drug intervention groups， airway inflammation and epithelial proliferation were alleviated to different degree compared to the model group. In model group， the collagen deposition was increased predominant type I collagen compared to the health comtrol group， and the deposition in the drug intervention groups were decreased compared to the model group， according to the Sirius redpolarizing microscopy morphometry method. The thickness of the airway wall in the model group was significantly increased compared to the health control group (P&<0.01)， and the thickness in the h30， h30， r 20 and r 34 (r 30 combined r 40) groups were significantly decreased compared to the model group respectively (P&<0.05). The thickness of collagen layer in model group was significantly increased compared to the health control group (P&<0.01) and the thickness in the h 20， h 30， h 40 and r 20 groups were significantly decreased compared to the model group respectively (P&<0.05). Conclusion The formula of nourishing Qi， activating blood circulation and dispersing phlegm recipe can inhibit airway remodeling and ameliorate airway obstruction in COPD， the mechanism may be inhibiting excessive deposition of ECM， so as to intervene airway remodeling in the early stage of COPD.
Key words：nourishing Qi and activating blood circulation and dispersing phlegm recipe；chronic obstructive pulmonary disease；animal model
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary isease，COPD)是以不完全可逆的气流受限为特征，常呈进行性加重，且多与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关[1]。其主要临床特征是肺功能的持续性下降。COPD的发病机
制尚未完全明了，目前公认炎症反应、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化应激是3条重要的作用途径，其中炎症反应占主导地位。笔者采用气道内灌注内毒素(LPS)加烟熏的复合方法复制COPD大鼠模型[2]，观察益气活血化痰中药对其肺组织形态学的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组与造模
清洁级Wistar大鼠64只，北京生物制品研究所动物中心提供，雌雄各半，体重(250±20)g，鼠龄12周，合格证号：SCXK(京2002-2003)。随机分为8组，每组8只。正常对照组：空白对照；模型组：分别于第1、8、15、23天气管内给予LPS 200 μg/200 μL，第2～7、9～14天每日给予大前门牌香烟烟熏30 min。从第20天起每日予温开水灌胃，1 mL/100 g体重；益气活血化瘀中药20、30、40天组(h 20、h 30、h 40组)：分别从造模第20、30、40天起每日予益气活血化痰方，按照1.83 g原药材/kg的剂量灌胃。罗红霉素20、30、40天组(r 20、r 30、r 40组)：分别从造模第20、30、40天起按照35 mg/kg剂量给予罗红霉素灌胃。于第91天测定肺功能，处死动物。
1.2 主要试剂及药物
LPS由美国Sigma公司生产(批号62012)；大前门香烟由北京卷烟厂生产；益气活血化痰方水煎液：由黄芪、清半夏、水蛭等按一定比例组成，药材购于北京中医药大学东直门医院，水煎醇沉后，浓缩至2 g/mL，将百令胶囊按人每天0.8 g，以体表面积折算率换算成大鼠等效剂量，溶解于益气活血化痰方水煎液中，冷藏储存；熏烟箱(35 cm×40 cm×50 cm)，北京中医药大学东直门医院药理实验室提供。
1.3 取材方法
腹主动脉放血处死动物后，迅速开胸分离肺脏，然后夹闭右肺，以0.9%氯化纳溶液3 mL灌洗左侧肺脏，松开右肺，夹闭左侧肺脏，用含有1/1 000 DEPC的4%多聚甲醛溶液在20 cm h3O压力下进行灌注固定，30 min后投入多聚甲醛溶液中固定1周。取固定好的组织，在最大横径处切3 mm厚的组织块，常规脱水，二甲苯透明，用自动石蜡包埋机包埋，切成4 μm厚的切片，进行常规苏木素-伊红(HE)染色、天狼星红染色、马逊染色。
1.4 支气管形态学测量方法
随机选取病理切片中内周长&<1 000 μm，长径/短径≤2，较规整的小支气管，每个标本选3～6个支气管横截面积，采用META MORPH图像分析系统中measure模块的region measure选项进行如下指标测量。管腔的内周长(Pi)及相应面积(Ai)；平滑肌层内侧、外侧面积(Asmi、Asmo)；气道外壁所围面积(the outer adventitial area，Ao)；管壁总面积(WAt)＝Ao－Ai，平滑肌层面积(WAsm)＝Asmo－Asmi，以内周长进行标准化，结果以单位长度的管壁面积(WAt/Pi，μm2/μm)表示管壁厚度，同样以单位长度的平滑肌层面积(WAsm/Pi，μm2/μm)表示平滑肌层的厚度。以固定颜色模式界定胶原，测定气道壁胶原面积(WAc)，同样以管壁内周长标准化，以WAc/Pi表示胶原层的厚度。
1.5 统计学方法
采用SARS9.0统计软件，数据用x±s表示，2组计量资料比较采用t检验，多组计量资料采用单因素方差分析及析因分析、两两间比较采用SNK检验，非正态分布资料采用非参数检验。
2 结果
2.1 肺组织病理形态学观察
2.1.1 苏木素-伊红染色
药物干预各组气道壁炎症及上皮层改变较模型组有不同程度的减轻。
2.1.2 天狼星红染色
偏振光下观察，COPD模型组小气道壁I型胶原较对照组增多，沉积于除上皮外的气道壁各层，固有膜胶原凸入高耸的上皮皱褶内，外膜胶原延伸至周围肺组织。用药组气道壁胶原沉积不同程度减少。Ⅲ型胶原各组表达均较少。
2.1.3 马逊染色
光镜下观察结果，模型组胶原纤维较对照组增多，药物干预组较模型组减少。
2.2 小气道形态学测量
(见表1、表2)表1 小气道形态学测量(略)注：与对照组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与模型组比较，#P&<0.05。r 34：r 30、r 40组由于取材原因，气道数较少，故合为1组，记作r 34。n为小气道数(下同)。表2 小气道胶原层厚度测量(略)
3 讨论
我们采用气管注入LPS加熏香烟复合法制备大鼠COPD模型，模型组肺组织病理形态学显示小气道上皮层增厚，管腔内炎细胞和黏液聚集，炎细胞侵及气道壁各层，管壁增厚，小气道周围肺泡腔扩大肺气肿形成。动物肺功能检查结果显示：模型组肺呼气总阻力(Re)较正常组升高，模型组最大通气量(MVV)、第0.3 秒用力呼气容积与用力呼气容积的百分比(FEV0.3/FVC)、用力呼气流速(FEF25-75)均较正常组降低，2组比较有显著性差异(P&<0.05)。本实验所建立动物模型病理形态和功能改变基本符合人类COPD的特点[3]。
支气管肺组织的炎症、损伤、修复、重塑是COPD不断进展的病理基础，细胞外基质过度沉积与小气道平滑肌层增厚共同构成COPD气道重塑的病理基础，其中以胶原为主的细胞外基质过度沉积在COPD气道重塑中占重要地位。细胞外基质增厚对气道阻力增高有显著影响，以气道形态结构分析为基础的数学模型显示：平滑肌层以内气道壁厚度的增加将会使一定量的平滑肌收缩时产生气道缩窄的效应增大，而平滑肌以外细胞基质沉积增加造成了外壁面积增加，致使气道-肺实质相互间的依赖作用(airway-parenchymal interdependence)减弱，从而使气道缩窄效应增强。Kuwano等[4]将气道壁分为3层：①内壁，上皮腔缘至平滑肌内缘；②平滑肌层；③外壁，平滑肌外的结缔组织层。内壁面积正常为20%，若平滑肌缩短30%，气流阻力可增加7.6倍；若内壁面积增至40%，同样平滑肌缩短30%，气流阻力可增加80倍，外壁增厚者若平滑肌缩短35%，气流阻力可较外壁正常者增加6～7倍。可见气道内、外壁胶原及其它细胞外基质增多，无疑可使气道的可塑性下降，尤其在平滑肌收缩和管腔内黏液聚集时，可导致气道阻力显著增高。
根据COPD的主要临床表现，应归属于中医“咳嗽”、“喘证”、“肺胀”等范畴。随着中医药防治COPD的广泛研究，对其病机认识日趋深入。王氏[5]认为气虚血瘀痰阻是COPD稳定期的主要病机特点，虚、痰、瘀是其病机关键，并提出益气活血化痰法是治疗COPD稳定期的重要方法。益气活血化痰方主要由黄芪、半夏、水蛭等药组成，方中黄芪为补气升阳之良药，善治脾气不足及肺气亏虚之证，对气虚血滞者可补气而行滞。半夏辛散消痞、化痰散结，与软坚散结之品同用，化络中之痰凝。水蛭功专破血逐瘀。方中诸药合用，共奏益气活血、化痰通络功效，使肺气得补，痰瘀同化，肺络隧通，气机调畅。
本实验中HE染色结合支气管形态学测量结果显示，模型组小气道腔内炎细胞浸润，黏液聚集，从造模20 d起管壁厚度及平滑肌较正常组显著增厚。模型组小气道壁各层Ⅰ型胶原显著增多。益气活血化痰中药复方20、30 d干预组炎症细胞数量减少，气道壁及胶原厚度较模型组显著减小；中药40 d干预组与模型组比较气道壁、胶原及平滑肌厚度统计学无显著差异。
本实验结果提示，益气活血化痰方可能主要通过抑制炎细胞浸润，干预以胶原为主的细胞外基质过度沉积、平滑肌的增生/肥大，从而干预COPD气道重塑，延缓气流受限进程。不同时间点给药气道重塑的严重程度不同，说明早期干预疗效更佳。早期给予罗红霉素也可以干预COPD模型大鼠气道结构重塑，其机理有待进一步研究。
【参考文献】
[1] NHLBI and WHO.Global strategy for the diagnosis， management， and prevention of chronic obstructive pulmonary disease[S].
2006.
[2] 金 焱，庞宝森，武维屏，等.一种实验性大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的建立[J].心肺血管杂志，2004，23(3)：179－181.
[3] 中华医学会呼吸病学分会.慢性阻塞性肺疾病诊治指南[J].中华结核和呼吸杂志，2002，25：453－460.
[4] Kuwano K，Bosken CH，Pare PD，et al.Small airways dimensions in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J].Am Rev Respir Dis，1993，148：1220－1225.
[5] 王 琦，武维屏，田秀英.益气活血化痰法防治肺胀的临床与实验研究[J].北京中医药大学学报，1994，17：44－48.