【摘要】 目的 观察益肾通肺汤对实验性慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及其组织抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响，以探讨其防治COPD的机理。方法 雄性Wistar大鼠36只，随机分为3组：空白组、模型组和治疗组。模型组大鼠两次气管内滴入脂多糖加被动吸烟复制COPD模型。治疗组给予益肾通肺汤。30 d后行支气管肺泡灌洗，计数灌洗液中细胞计数及分类，免疫组化方法观察肺组织MMP-9和TIMP-1的表达情况。肺组织切片行苏木素-伊红(HE)染色，观察形态学改变。结果 模型组MMP-9和TIMP-1的表达与空白组相比明显增强(P&<0.01)。治疗组与模型组相比，MMP-9和TIMP-1的表达相对减弱(P&<0.01)。结论 益肾通肺汤能降低COPD大鼠肺组织中MMP-9和TIMP-1的表达，起到防治COPD的作用。
【关键词】 益肾通肺汤；慢性阻塞性肺疾病；基质金属蛋白酶-9；基质金属蛋白酶组织抑制因子-1；脂多糖
Abstract：Objective To explore the role of prevention and treatment of Yishentongfei decoction in COPD by measuring the expression of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue. Methods 36 male Wistar rats of rat model with chronic obstructive pulmonary disease was established by exposure to cigarette smoke daily for 30 days and injection of LPS in trachea twice. The rats were randomly separated into three groups， the normal group， the model group and the treatment group. Total cell counts and neutrophil counts in BALF were examined. The expression of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue was measured by means of immunohistochemistry (SP). Lung tissue section stained by HE was observed to study the morphological alternations. Result The expression of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue of the model rats significantly increased compared with the normal rats (P&<0.01)， and decreased relatively compared with the treatment rats (P&<0.01). Conclusion Yishentongfei decoction can reduce the expression of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue of rat model of COPD， and has effect on the prevention and treatment of COPD.
Key words：Yishentongfei Decotion；COPD；MMP-9；TIMP-1；LPS
基质金属蛋白酶 (MMP)是近年来发现的一组由锌、钙离子依赖性，结构相似的基质降解蛋白酶组成的蛋白酶家族，近年研究表明，MMP参与肺组织细胞外基质破坏、重塑以及炎细胞趋化，在慢性阻塞性肺疾病(COPD)形成、发展、炎症持续方面起了重要作用。我们采用气管内注入脂多糖(LPS)和反复烟熏的方法制作COPD大鼠模型，采用免疫组化法检测MMP-9及其组织抑制因子-1(TIMP-1)在COPD大鼠支气管肺组织中的表达，以探讨二者在COPD发病中的作用。
1 实验材料
1.1 动物
健康成年雄性Wistar大鼠36只(购自兰州医学院实验动物中心，合格证号：医动字第14-006号)，体重(250±20)g，鼠龄10周。
1.2 药物
益肾通肺水煎液(由人参、蛤蚧、苏木、葶苈子、水蛭、紫菀组成)，200%浓度，甘肃中医学院附属医院中药制剂室提供。
1.3 仪器及试剂
德国LEICARM 2135型石蜡切片机，石蜡包埋机；德国LEICARM 1020型脱水机；动物熏吸箱，甘肃中医学院附属医院呼吸科自制；LPS购自美国Sigma公司。
2 实验方法
2.1 分组
大鼠随机分为3组。对照组(A组，12只)：正常饲养，灌服等量生理盐水。益肾通肺汤治疗组(C组，12只)：在制备COPD模型的同时，于每天熏香烟前按24 g/(kg?d)灌服1 g/mL的益肾通肺汤煎液。模型组(B组，12只)：分别于第1、14天气管内注入LPS(200 μg/200 μL)；第2～30天(第14天除外)兰州牌过滤嘴香烟(焦油烟量15 mg，烟气烟碱量1.0 mg)烟雾；每日上下午分别将大鼠置于72 L的密闭玻璃箱内，将香烟插在50 mL注射针头上，点燃经玻璃箱顶盖的通气孔伸入玻璃箱，先缓慢抽吸烟雾于空针内，再将烟雾推入玻璃箱内，如此反复，使玻璃箱内烟雾浓度达5%左右，30 min后将大鼠移出玻璃箱，每日熏2次。30 d后进行以下实验。
2.2 动物处理
先将动物称重，腹腔内注入2%戊巴比妥钠(25 mg/kg)麻醉，将大鼠仰卧位固定，沿正中线剪开皮肤和腹壁肌肉，剪断两侧肋骨和胸肌，暴露胸腔，从喉头以上剪断气管，将胸腔脏器摘除，一并取出心脏，分离出肺脏。用生理盐水10 mL分3次行左肺支气管肺泡灌洗，总回收率为50%～80%，灌洗液(BALF)行白细胞计数及分类；于右下肺矢状面最大周径处横贯取材，10%中性甲醛固定，24 ｈ内石蜡包埋、切片。
2.3 MMP-9和TIMP-1的检测
采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法(武汉博士德公司，SP即用型试剂盒)在石蜡切片上测MMP-9和TIMP-1的免疫组化表达，一抗为1∶100 MMP-9和TIMP-1多克隆抗体，二抗为生物素山羊抗兔IgG，阴性对照标本除以PBS代替一抗外，其它步骤与被测标本相同，阳性反应为胞浆中出现棕黄色颗粒。
2.4 统计学方法
全部数据用SPSS13.0统计软件处理，计量资料采用x±s表示，组间采用T检验，计数资料行χ2检验。
3 结果
3.1 灌洗液白细胞计数及分类
(见表1)表1 3组BALF中白细胞计数及分类比较(略)
3.2 支气管肺组织MMP-9、TIMP-1免疫组化结果
(见表2) 表2 MMP-9、TIMP-1免疫组化表达分析(略)注：与A组比较，#P&<0.01；与B组比较，△P&<0.01；免疫组化表达分析实验过程空白组、模型组各死亡大鼠1只。
3.3 慢性阻塞性肺疾病模型组病理学改变
模型组支气管肺组织病理表现基本符合人类慢性支气管炎及阻塞性肺气肿的特点。光镜下见支气管纤毛柱状上皮细胞部分脱落，杯状细胞增生，支气管黏膜下肌层增生、肥厚，黏膜层、黏膜下层及肌层大量炎性细胞浸润；细支气管壁周围可见较多炎性细胞浸润，肺泡壁变薄、胀大、破裂或形成大泡，弹力网破坏。
4 讨论
吸入有害物质引起肺与气道的持续炎症病变是引起COPD的关键。本实验采用两次气管内注入适量LPS和反复烟熏的方法制作COPD大鼠模型。结果表明，模型组支气管肺组织病理形态学基本符合人类慢性支气管炎及阻塞性肺气肿的特点。而且，模型组MMP-9和TIMP-1的表达与空白组相比明显增强(P&<0.01)，说明此法可用于COPD气道重塑的研究。
MMP是降解气道各种细胞外基质的主要酶类，MMP-9(明胶酶B)主要降解弹力纤维及明胶Ⅳ、Ⅴ型胶原。本研究显示，模型组大鼠支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、支气管肺组织微小血管内皮细胞MMP-9表达显著增强。提示MMP增多可破坏肺泡基质成分使肺泡腔扩大，肺泡弹性回缩能力减弱，从而导致气体滞流[1]。另一方面，通过介导炎症细胞聚集和破坏上皮/内皮结构，参与炎症反应和组织重建，炎症细胞在气道腔及气道壁中聚集，加重了局部的炎症反应，导致气流阻塞。因此，减轻气道重塑是进行有效防治的先决条件。
TIMP是MMP的内源性抑制剂，由成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和血管内皮细胞等产生。TIMP-1能特异性地与MMP-9结合并抑制其活性。TIMP还具有细胞生长因子样作用，可促进成纤维细胞增生及胶原合成，使细胞外基质沉积并抑制其降解。因此，TIMP-1是气道纤维化的标志，反映了气道修复及重塑过程[2-3]。本实验COPD模型组TIMP-1的表达显著强于对照组，其表达部位与MMP-9相似，这可能与其抑制MMP的功能有关。因此，TIMP-1是气道重塑的重要因子，与MMP-9一起参与支气管、肺泡壁的损伤及修复过程。本实验COPD模型组支气管肺组织MMP-9和TIMP-1表达均显著增加，表明细胞外基质的降解及合成代谢均异常活跃，TIMP-1在抑制MMP-9活性的同时，也引起胶原过度沉积。
益肾通肺汤以肾主纳气为立法依据，以补肾纳气平喘，益气活血祛痰为治则。方中人参、蛤蚧相配补益肺肾、纳气定喘以治本；苏木与人参相配益气活血；葶苈子泻肺祛痰；水蛭活血化瘀；紫菀止咳平喘。本研究发现，应用益肾通肺汤后治疗组大鼠MMP-9和TIMP-1的表达均明显下降，且细胞计数显示炎性细胞数显著降低。提示通过对MMP-9和TIMP-1的抑制，从而使肺脏基质的降解减少和炎症细胞的聚集趋化减轻，可能是益肾通肺汤干预COPD形成的机制之一。
参考文献
[1] 曾 琼.炎症细胞、基质金属蛋白酶与肺气肿[J].国外医学?呼吸系统分册，2000，20(3)：163－166.
[2] Hayakawa T.Tissue inhibitor of metalloproteinases and their cell growth promoting activity[J].Cell Struc Funct，1994，331：1286－1292.
[3] 张志刚，郭慕依.基质金属蛋白酶及其抑制剂与疾病的关系[J].国外医学?生理、病理科学与临床分册，1997，17(4)：351－353.