作者：吴红，梁恒，刘永红，袁忠海
【关键词】 山茱萸
【Abstract】 AIM: To review effects of different methods of extracting total saponins from Cornus officinalis so as to provide an effective way to accurately determine total saponins. METHODS: ① Methanol reflux， ② Ether degreasing Methanol reflux， ③ Ultrasonic abstraction， ④ Method of macroreticular absorption resin and ⑤ Ethanol reflux were compared. With Ginsenoside Re and Oleanolic acid as standard， chromatometry was used respectively to determine total saponins of different extraction solution. RESULTS: The content of total saponins determined by methods of ①， ②， ③ and ⑤ was 5.95%， 6.98%; 2.87%， 3.12%; 3.80%， 3.92%; 6.17% and 8.13% respectively， and by method of ④， it was 1.52% and 1.73%. CONCLUSION: Different extracting methods have much influence on determining total saponins in Cornus officinalis.
【Keywords】 cornus officinalis; total saponins; extraction; content determination
【摘要】 目的： 考察不同提取方法对山茱萸总皂苷测定的影响，为准确测定山茱萸皂苷的含量提供可行方法. 方法： ① 甲醇回流法；② 乙醚脱脂甲醇回流提取法；③ 超声法；④ 大孔树脂法；⑤ 乙醇回流法. 上述方法分别用人参皂苷Re、齐墩果酸作对照，比色法测定不同提取液中总皂苷的含量. 结果： ①， ②， ③和⑤提取法所测总皂苷含量分别为：5.95%，6.98%；2.87%，3.12%；3.80%， 3.92%; 6.17%和8.13%. ④ 法测定总皂苷含量为1.52%和1.73%. 结论： 不同提取方法对山茱萸总皂苷含量的测定有较大的影响.
【关键词】 山茱萸；总皂苷；提取；含量测定
0引言
随着现代文明的飞速发展，延缓衰老，健康长寿已为人们日益期盼，名贵中药山茱萸因含有丰富的营养成分和珍贵的保健成分日益成为研究热点. 山茱萸(Cornus officinalis sieb. et Zucc.)又名枣皮，是我国40种用量大的骨干药材之一，是中、日、朝三国使用频率最高的25种植物药之一，具有补肝肾、涩精气、降血糖、抗菌、利尿、降压和免疫等功效［1］. 近代药理学研究表明，山茱萸水溶液提取物（总皂苷）有明显的免疫抑制活性，并对肾阳虚动物模型生命质量及多个脏器具有保护作用［2］. 山茱萸的化学成分主要含有环烯醚萜苷类、皂苷、多糖、熊果酸、齐墩果酸、鞣质等［1， 3］. 化学成分分析表明，山茱萸中疗效保健成分主要是齐墩果烷系皂苷（其水解后的苷元为齐墩果酸和熊果酸）、马钱素及莫诺苷等苦味素物质. 目前已发现山茱萸中含有8种苷［1］，但对总皂苷的含量报道不一［4， 5］. 皂苷由其苷元与多分子糖或糖醛酸组成，鉴于目前尚无山茱萸皂苷类成分的法定对照品，我们选用结构与山茱萸皂苷类成分接近的单体皂苷（人参皂苷Re）及其苷元（齐墩果酸）作对照，采用比色法计算总皂苷含量. 由于比色法中总皂苷的提取方法及分离方式直接影响比色测定的结果，因此我们对 5种不同提取方法的总皂苷含量进行了比较.
1材料和方法
1.1材料F120型高速药物粉碎机（80~200目）；Unico 2100型紫外可见分光光度计 (尤尼柯上海仪器有限公司 )；DZF型真空干燥箱； Sartorius BP221S电子天平；SB5200D超声清洗器. 山茱萸药材样品由汉江制药厂提供并鉴定；HPD300型大孔树脂 (河北沧州宝恩化工有限公司) ；人参皂苷Re、齐墩果酸标准品 (中国药品生物制品检验所 )；香草醛、高氯酸、冰醋酸、甲醇均为分析纯；GF254薄层板；展开剂：正丁醇乙酸乙酯水（4∶1∶5）上清；100 g・L-1硫酸显色.
1.2方法
1.2.1山茱萸总皂苷提取方法① 甲醇回流法：精密称定60℃干燥至恒重的山茱萸粉末（80目）2.0010 g，置 50 mL圆底烧瓶中，准确加入甲醇25 mL，水浴回流6 h，倾出提取液，续加甲醇20 mL，回流提取3 h，离心过滤，减压浓缩，定容至10 mL. ② 乙醚脱脂甲醇回流提取法：取60℃干燥至恒重的山茱萸粉末2.0011 g，置索氏抽提器中，以乙醚脱脂至无色，挥散乙醚，继续用甲醇回流提取约6 h，回收甲醇至少量，以甲醇定容至10 mL容量瓶中，离心取上清液备用. ③ 超声法［6］：精密称定山茱萸粉末 2.0010 g，加入甲醇 25 mL，浸泡30 min，超声提取 30 min，减压过滤，再分别加入甲醇20， 10 mL，分别超声20， 10 min，离心，上清液减压浓缩至干，残渣加水6 mL溶解后，以乙醚脱脂 2次，合并乙醚液并用少量水洗涤，弃去醚层，将洗液与水层合并，减压浓缩定容至10 mL备用. ④ 大孔树脂法［7］：精密量取超声法提取液5 mL上HPD300大孔吸附树脂，蒸馏水洗涤除糖后，再以 700 mL・L-1乙醇冲洗，收集洗脱液至薄层显色无紫色斑点出现为止，浓缩后放真空干燥箱干燥，甲醇溶解并定容至10 mL. 精密吸取 5 μL，按标准曲线制备项下方法进行测定. 根据回归方程，计算其中总皂苷含量（每mL含生药0.2 g）. ⑤ 乙醇提取法［8］：山茱萸粗粉用700 mL・L-1乙醇回流提取，过滤，回收至无乙醇味，加蒸馏水适量，冰箱内静置24 h后，离心得山茱萸样品液.
1.2.2山茱萸皂苷类别的鉴定取两支试管，分别加入5 mL 0.1 mol・L-1 HCl及0.1 mol・L-1 NaOH，再各滴加3滴山茱萸提取液，振摇1 min，碱液管棕色透亮，酸液管呈混浊状，静置后有粉红色固体吸出，酸液管泡沫较碱液管泡沫持久，说明山茱萸中的皂苷主要为三萜皂苷.
1.2.3标准曲线的绘制［9］① 齐墩果酸标准曲线：精密称定齐墩果酸4.8 mg，加甲醇定容至 2 mL容量瓶中，精密吸取5， 10， 15， 20， 25 μL置具塞试管中，挥去甲醇，精密加入新配制的50 g・L-1香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，混匀，于65℃水浴中加热20 min，冰水冷却后，精密加入乙酸乙酯 5 mL，摇匀. 以未加标准品的相同试剂作空白，560 nm处测定吸光度A，绘制标准曲线. 线性范围12~60 μg，回归方程：A=0.0103c+0.03255，c为浓度（mg・L-1）， R2 = 0.9976 （P&<0.01）. ②人参皂甙Re标准曲线：精密称取人参皂甙5.6 mg，加甲醇溶解并定容至2 mL，精密吸取5， 10， 15， 20， 25 μL于具塞试管中，吹干，精密加入0.2 mL 50 g・L-1香草醛冰醋酸、0.8 mL高氯酸，振摇混匀后于 65℃水浴加热20 min，冰水冷却后，加冰醋酸5 mL摇匀，554 nm处测定吸光度A值. 回归方程：A=-0.0068c+0.02554，R2= 0.9998 (P&<0.01)线性范围14~70 μg.
1.2.4总皂苷含量测定精密吸取上述不同方法提取的山茱萸提取液各10 μL，按标准曲线制备项下方法进行测定，然后根据回归方程计算其中总皂苷含量.
2结果
分别以人参皂苷Re、齐墩果酸为对照，求得不同提取方法山茱萸总皂苷含量(Tab 1).
表1不同提取方法山茱萸总皂苷的含量（略）
Tab 1Total Sapanins content of different extracting methods on Cornus officinalis Sieb. et Zucc.（略）
同一对照品溶液根据人参皂苷Re标准曲线，显色后每隔10 min测定 1次含量. 结果表明该样品显色后在40 min内稳定，测定值的相对标准偏差RSD为 2.52%. 取已知含量的样品液3份，分别加入人参皂苷Re，按Re标准曲线测定含量. 平均加样回收率为 99.28%，RSD1.91% (n= 3).
我们采用不同方法所得提取液，除大孔树脂法可除去糖类杂质外，均未经正丁醇萃取除去小分子糖，这是因为该显色反应在 60℃时糖类物质几乎不反应，对吸光度影响不明显，故省去该步骤. 由于香草醛冰醋酸试剂与山茱萸皂苷的显色反应极为灵敏，温度、时间对实验结果影响较大，因此显色时间和温度应严格控制，加入醋酸和测定吸收值前，试管一定要置冰水浴中，并及时测定. 另外加热显色前一定要充分振摇，否则实验误差较大.
皂苷的分析测定有多种方法，如沉淀法、溶血指数法、质量法、层析法、吸附法及皂苷指数法［10］. 沉淀法测定往往易带进杂质或导致皂苷变质；层析法一般可以分离出总皂苷，但对总含量测定不适，误差大，成本高；吸附法可以较快分离出总皂苷，但也易吸附其他物质如糖、鞣质和色素等，同时洗脱时也不易全部洗出. 为此我们考察了不同处理方法对总皂苷含量的影响. 甲醇回流法及乙醇回流法因没有脱脂，直接回流提取，杂质较多，故所测皂苷的含量明显高出其他方法；乙醚脱脂甲醇回流提取法与超声法相比，后者是在超声提取后用乙醚脱脂，除杂效果不及乙醚脱脂甲醇回流提取法，测定值亦偏高. 由此可见药材的前期处理直接影响着总皂苷含量的测定结果. 同时各地区、不同品种的山茱萸总皂苷含量也有较大差别. 大孔树脂为一类新型非离子型高分子化合物，近年来已广泛应用于天然产物的分离与富集，尤其适用于水溶性化合物，如皂苷、黄酮及生物碱等的分离与富集，但在山茱萸总皂苷提取分离方面尚未有报道. 实验过程中发现样品液上样前低温处理较好，且树脂吸附量也大一些，这可能是因为中药成分在树脂上的吸附为一放热过程，低温有利于提高中药成分的比上柱量. 上柱后所测含量偏低，可能是部分皂苷未被洗脱.
目前国内尚无山茱萸皂苷类成分的法定对照品，故选用结构与山茱萸皂苷类成分接近的单体皂苷及其苷元作对照，采用比色法计算总皂苷含量. 虽然测定结果有一定出入，但由于它们的显色原理一致，故暂无法定标准品的情况下，仍不失为一种较佳的选择. 以皂苷元为基体的定量分析，是以皂苷元的量标定其中皂苷的含量，从实验结果看，此法所测皂苷含量普遍高于以人参皂苷Re为标准测得的含量，这是因为中药中微量的有机酸类也能发生上述反应，此外测定结果的准确程度亦受水解条件的制约.
参考文献
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