【关键词】 中草药
【Abstract】 AIM: To screen some Chinese traditional herbs against periodontopathic bacteria and test their minimal inhibitory concentration (MIC). METHODS: After being extracted with 650 mL・L-1 ethanol， Chinese traditional herbs which possessed bacteriostatic potentials against periodontopathic bacteria were screened by means of disk agar diffusion method .Using broth dilution method， their MIC were determined. RESULTS: Crude extracts from Allium sativum.L， Flos caryophylli， Alliumcepa L， Cortex magnoliae officinalis， Quercus infectoria， Semen arecae and the mixture of Radix glycyrrhizae and Radix platycodi markedly inhibited both B. forsythus 43037 and P. gingivalis 33277. AgainstB. forsythus 43037， MIC was 1.25， 3.90， 7.80， 1.95， 31.25， 31.17， 7.80 g・L-1 respectively; Against P. gingivalis 33277， MIC was 0.63， 3.90， 1.95， 1.95， 30.42， 15.60， 62.50 g・L-1 respectively. CONCLUSION: Some Chinese traditional herbs have strong antimicrobial activity against periodontopathic bacteria.
【Keywords】 Chinese traditional herbs; P.gingivalis; B.forsythus; minimal inhibitory concentration (MIC)
【摘要】 目的： 对可能应用于口腔疾病的中草药进行横向比较和筛选，寻找具有抗牙周病菌能力的中草药. 方法： 采用650 mL・L-1乙醇溶液作为溶剂，从实验药物中分别提取有效部位，通过纸片扩散法筛选能抑制牙周病菌生长的中草药；并用液体稀释法检测其最小抑菌浓度. 结果： 大蒜、丁香、洋葱、厚朴、没食子、槟榔及复方甘草和桔梗对各实验菌株呈现明显的抑菌圈；对B.forsythus 43037的最小抑菌浓度分别为1.25， 3.90， 7.80， 1.95， 31.25， 31.17和7.80 g・L-1;对P.gingivalis 33277的最小抑菌浓度分别为0.63， 3.90， 1.95， 1.95， 30.42， 15.60和62.50 g・L-1. 结论： 筛选出一批抑制牙周病菌生长的天然药物，为中草药防治牙周病的深入研究提供基础材料.
【关键词】 中草药；牙龈卟啉菌；福赛类杆菌；最小抑菌浓度
0引言
牙周病是牙菌斑是口腔两大类主要疾病之一，最初发病的始动因子. 菌斑细菌可通过毒性产物进入或细菌本身侵入牙周组织，直接破坏牙周组织;或通过抑制宿主的防御功能而引发变态反应等，间接地损害牙周组织. 因此抑制牙周病原菌对预防牙周病具有重要的作用. 已有充分证据表明，牙周菌斑中牙龈卟啉菌（Porphyromonas gingivalis）和福赛类杆菌（Bacteroides forsythus）与牙周病的发生密切相关［1］ . 我们通过体外抑菌实验，筛选出一批抑制牙周病菌生长的天然药物，并测定其最小抑菌浓度，探讨中草药在牙周病防治中的应用前景.
1材料和方法
1．1材料单味中草药: 洋葱(Alliumcepa L， AL)、大蒜(Allium sativum .L， As.L)、花椒(Pericarpium zanthoxyli， Pz)、丁香(Flos caryophylli， Fc)、 山柰(Kaempferia galanga. L， Kg.L)、连翘(Fructus forsythiae， Ff)、牛蒡子(Fructus arctii， Fa)、细辛(Hherba asari， Ha)、厚朴(Cortex magnoliae officinalis， Cmo)、甘草(Radix glycyrrhizae， Rg)、决明子(Semen cassiae， Sc)、荆芥(Herba schizonepetae， Hs)、姜黄(Rhizoma curcumae longae， Rcl)、射干(Belamcanda chinensis Dc， Bc.D)、没食子(Quercus infectoria， Qi)、黄柏(Cortex phellodendri， Cp)、桔梗(Radix platycodi， Rp)、槟榔(Semen arecae， Sa)；复方药: 细辛荆芥(HaHs)、细辛姜黄(HaRcl)、细辛黄柏(HaCp)、姜黄甘草(Rcl Rg)、甘草桔梗(Rg Rp). 洋葱、大蒜购自武汉洪山农贸市场，其他药材均购自湖北省中药材公司.
实验菌株 P. gingivalis 33277和B. forsythus 43037由武汉大学口腔医学院中心实验室提供.
1．2方法
1．2．1试剂的配制胰酪大豆肉汤的制备：称取3 g胰酪大豆液体培养基（TSB），溶于100 mL蒸馏水中，121℃， 15 min灭菌备用；TS血平皿的制备：称取4.4 g胰酪大豆琼脂培养基（TSA），溶于100 mL蒸馏水中，121℃， 15 min灭菌，待冷却至50℃ 左右，加入无菌脱纤维羊血5 mL，倾注于平皿备用；氯化血红素（5 mL・L-1）：50 mg氯化血红素溶解于1 mL的1 kmol・L-1 NaOH中，加蒸馏水至100 mL，121℃ 15 min 灭菌；氯化血红素维生素K1溶液（HK）：5 mL・L-1氯化血红素溶液100 mL加入一支维生素K1溶液（10 g・L-1），4 ℃保存；TSHK肉汤的制备：称取3 g TSB培养基，溶于100 mL蒸馏水中，121℃，15 min灭菌，待冷却至50 ℃左右，加入1 mL氯化血红素维生素K1溶液；TSAHK血平皿的制备：称取4.4 g TSA培养基，溶于100 mL蒸馏水中，121℃， 15 min灭菌，待冷却至50℃ 左右，加入5 mL无菌脱纤维羊血，1 mL氯化血红素维生素K1，混匀，倾注于平皿备用.
1．2．2天然药物的提取新鲜大蒜剥皮，取100 g，置乳钵内，捣成糊状，过0.5 h后以100 mL 650 mL・L-1乙醇浸泡1 wk，取出过滤. 滤液4℃密封保存；新鲜洋葱200 g切碎，加4倍量650 mL・L-1乙醇，回流2次，每次2 h， 趁热过滤， 合并滤液，回收乙醇，浓缩至200 mL，4℃密封保存；干燥植物药粉末100 g，加4倍量650 mL・L-1乙醇，回流两次，每次2 h，趁热过滤，合并滤液，回收乙醇，浓缩至100 mL，4℃密封保存. 各种药物终浓度均为1 kg・L-1. 用打孔器将滤纸制成直径为6 mm的纸片，并分装成每包40张的小包干热灭菌备用. 取实验药液0.2 mL浸泡40张纸片，使其充分浸匀后放置无菌平皿中在37℃烘干. 活化P. gingivalis 33277，B. forsythus 43037， 800 mL・L-1 N2， 100 mL・L-1 CO2， 100 mL・L-1 h3， 37℃培养18 h，调吸光度A550 nm值为0.1.
1．2．3抑菌实验纸片扩散法： 取50 μL已标化的P. gingivalis 33277或B. forsythus 43037菌液，均匀涂布于TSAHK血琼脂表面，在已涂布实验菌液的琼脂表面等距离贴上含药纸片. 800 mL・L-1 N2，100 mL・L-1 CO2， 100 mL・L-1 h3， 37℃，培养24 h. 测定抑菌圈直径. 液体稀释法： 用TSB培养基将待测药物稀释成系列二倍递减的实验药物浓度，然后与等量实验菌液混合，800 mL・L-1 N2， 100 mL・L-1 CO2， 100 mL・L-1 h3， 37℃，培养48 h，观察MIC结果. 凡肉眼观察无细菌生长，即实验管内液体清亮无混浊的最低药物浓度为该药物的MIC.
统计学处理：各组实验数据用x±s表示，应用SPSS10.0统计软件进行非参数秩和检验.
2结果
2．1抗牙周病菌中草药的筛选以抑菌圈直径&>10 mm为抗菌阳性标准，结果发现，大蒜丁香洋葱厚朴没食子槟榔及复方甘草和桔梗对B.forsythus 43037和P.gingivelis 33277呈现明显的抑菌圈（Fig 1）.
1: Kg・L; 2: Ff; 3: Fa; 4: Ha; 5: Rg; 6: Sc; 7: Pz; 8: Hs; 9: Rcl; 10: Bc・D; 11: Qi; 12: Cp; 13: Rp; 14: As・L; 15: AL; 16: Fc; 17: Cmo; 18: HaRs; 19: HaRcl; 20: HaCp; 21: RclRg; 22: RgRp; 23: Sa.
图1各种中草药对两种牙周病菌生长的影响（略）
Fig 1Effects of Chinese herbal medicines on growth of periodontopathic bacteria（略）
2．2最小抑菌浓度用液体稀释法测得的不同中草药提取液对牙周病菌的最小抑菌浓度(Tab 1). 其中大蒜的粗提物抑菌效果最好，在浓度为0.63和1.25 g・L-1时，能分别抑制P.gingivalis 33277和B.forsythus 43037的生长.
表1中草药对牙周病菌的最小抑菌浓度（略）
Tab 1MIC of Chinese traditional herbs against periodontopathic bacteria（略）
3讨论
牙周病较为常见，在用于实验的天然药物中，大蒜对牙周病微生物的抑制效力最强. 大蒜的抗菌作用可能是由于使巯基失活从而抑制了与微生物生长繁殖有关的含巯基的酶的缘故. 大蒜中的有效成分蒜素性质很不稳定，遇碱遇热易分解，故在提取过程中采用冷浸法. 洋葱抗菌活性成分对变形链球菌及牙周主要致病菌有杀菌作用［2］；我们证实了洋葱对牙周菌有较强抑制作用，对P.gingivalis 33277和B. forsythus 43037的最小抑菌浓度分别为1.95 g・L-1和7.80 g・L-1. 结果表明，槟榔对两种实验菌株均具有一定抑制作用. 此外，我们还发现丁香对牙周病菌有明显的抑制作用，对P.gingivalis 33277和B.forsythus 43037的抑菌圈分别为16.6 mm和15.2 mm. 大蒜、丁香和洋葱等既是药物又是食物，从医食同源的概念出发，对食物中的生物活性成分进行防治口腔疾病的研究是一条值得重视的途径.
没食子的抑菌圈明显分为5个层次，从内到外分别为棕黑色、透明层、深棕色、黄色、浅棕色，表明没食子的抑菌成分至少有5类，这几种有效抗菌成分有待进一步确定. 厚朴为木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的树皮或根皮，具多种生物学功能，如抗感染［3］、抗过敏［4］、抗癌［5］等，用于消炎灭菌、胸腹胀满、肠梗阻、痰饮喘满等症；其主要成分厚朴酚（magnolol）有良好抗龋作用. 我们发现厚朴的粗提物对牙周病原菌同样具有具有较强抑制作用，对P.gingivalis 33277和B.forsythus 43037的MIC均为1.95 g・L-1. 甘草和桔梗单味药对P.gingivalis 33277和B.forsythus 43037的生长无影响，但它们组成的复方对牙周病菌有一定抑菌效果. 甘草是我国民间防治口腔疾病常用验方之一［6］，甘草和桔梗的复方制剂对口腔病菌有更强的抑制作用，可能是由于远志酸与甘草次酸有协同作用，分别作用于体内多个靶组织上，产生显著而且全面的药效作用，最大限度地达到从整体上治疗疾病的目的.
【
参考文献
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［3］ Lee MM， Huang HM， Hsieh MT， Chen CS， Yeh FT， Kuo JS. Antiinflammatory and neuroprotective effects of magnolol in chemical hyporcia in rat cultured cortical cells in hypoglycemic media ［J］. Zhonghua Shengli Zazhi (Chin J Physiol)， 2000;43(2):61-67.
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