作者：王新文，金岩，刘源，王军琳，赵宇，董蕊
【关键词】 大T抗原
【Abstract】 AIM： To investigate the role of SV40 large T (LT) antigen on human skin fibroblasts transformation and to observe the biological alteration of the cells. METHODS： Human skin firbroblasts were cultured and transfected with eukaryotic expressing plasmid psv3neo which containing the large T. After selection by G418 to stabilize the transfection， the large T mRNA and phenotypical changes of the transformants were examined. RESULTS： LT cDNA transformed cell colonies were isolated and were subcultured. LT mRNA expressed within the cytoplasm in most transformed cells when determined by in situ hybridization. After a period of time， however， the transfected cells gradually entered crisis and died. CONCLUSION： The ability of LT to enable the normal human skin fibroblasts immortalized is limited. So it is impossible to establish immortalized human skin fibroblast cell line only by large T.
【Keywords】 SV40; large T antigen; skin； fibroblasts
【摘要】 目的: 研究SV40大T抗原(LT)基因对人正常皮肤成纤维细胞体外转化作用， 以及转化后细胞生物学特性的改变. 方法: 采用脂质体介导的方法，利用含有LT cDNA的质粒psv3neo转染人正常皮肤成纤维细胞. G418筛选后，挑选阳性克隆扩大培养，观察基因及蛋白在细胞内的表达，以及对细胞增殖等生物学特性的改变情况. 结果: 分离获得转化细胞克隆，原位杂交显示LT mRNA在转染细胞胞质中表达. 免疫组化结果显示，细胞质中有SV40大T抗原表达. 细胞计数、BrdU、流式细胞仪检测表明，经过一段时间的旺盛生长，在转染后第16代，细胞即进入危机期，以一种比衰老细胞更快的速度死亡. 结论: LT 可以促进正常皮肤成纤维细胞增殖，但这种能力是有限的，在转染后期甚至会促进细胞死亡. 所以要使人的正常皮肤成纤维细胞永生化，单纯利用LT的转染是不够的，还需要结合其它的转化方式.
【关键词】 SV40；大T抗原；皮肤；成纤维细胞
0引言
成纤维细胞是皮肤真皮部分的主要细胞成分，对皮肤起营养、支持和免疫作用. 皮肤成纤维细胞作为正常体细胞的一种，生命期有限，通常在40代左右即出现衰老［１］，继而增殖缓慢，逐渐死亡. LT cDNA的转染一直是非造血细胞永生化最常用的方法. 为获得性状稳定、能够长期培养的皮肤成纤维细胞，更好地满足基础研究和相关疾病的治疗，我们准备利用LT能使细胞向永生化趋势转变的特点，应用基因转染技术，研究LT对人皮肤成纤维细胞体外转化作用以及转化后细胞生物学特性的改变.
1材料和方法
1.1材料含有LT cDNA的质粒(psv3neo由Berg教授惠赠)，皮肤组织(流产胎儿背部)，DMEM培养基、胎牛血清(Gibco)，Lipofect AMINE 2000 Reagent 转染试剂盒(Invitrogen)，Biotek凝胶回收试剂盒(Omega)，原位杂交标记和检测试剂盒(Boehringer Mannheim)，SV40大T抗原抗体(Santa Cruz)，免疫组化检测试剂盒(DAKO)，BrdU检测试剂盒(Sigma)， EcoRⅠ和PvuⅡ内切酶(Promega).
1.2方法
1.2.1细胞培养参照鄂征［２］所描述的方法，将真皮成纤维细胞制成细胞悬液后，离心.用含有100 mＬ・L-1胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，按（2～4）×107・L-1细胞密度将成纤维细胞接种到上述培养基中.12 h后换1次液体，以后3 d换1次液体，观察细胞形态. 细胞长到80%后，用2.5 g・L-1胰酶消化，按14传代.
1.2.2质粒转染及细胞克隆的分离将传至第16代的皮肤成纤维细胞，接种到6孔板，每孔细胞数为2×105 .次日进行转染（转染过程按说明书进行）.转染后培养24 h，细胞接近汇合时，按110 密度传代，继续培养.待密度接近50％-70％时，加0.4 g・L-1的G418进行筛选，未转染细胞作为对照.6 d后，对照细胞全部死亡，将筛选液浓度降至0.2 g・L-1，2~3 wk出现抗性克隆分离细胞克隆，重新接种培养.分别取未转染和转染细胞进行检测.
1.2.3LT mRNA表达检测 EcoRⅠ／PvuⅡ双酶切质粒psv3neo后，10 g・L-1琼脂糖凝胶电泳后，分离片段，用凝胶回收试剂盒，获得4.8 kb大小的LT cDNA，用随机引物法对该片段进行标记. 取转染后第3代和第16代细胞爬片，进行原位杂交，检测LT mRNA的表达情况.正常细胞作为阴性对照.
1.2.4SV40大T抗原检测取转染后第3代细胞爬片，利用免疫组化SABC法进行SV40大T抗原表达检测.步骤按说明书进行.
1.2.5细胞生长曲线分别取第3，19，32代未转染细胞和转染后第3，16代细胞，按1×103・cm-2的密度接种到24孔板，隔日进行细胞计数.分别取３个孔，取平均数.连续检测5次， 绘制细胞生长曲线.
1.2.6BrdU检测分别取第3，19，32代未转染细胞和转染后第3，16代细胞.实验前1 d接种细胞到放有玻片的培养板中，持续培养，到细胞密度50％-80％时，吸弃培养液，加入含1 mL・L-1BrdU的培养液，继续培养4 h，取出细胞爬片用抗－BrdU mAb检测，每一组取10个标本进行阳性细胞计数，组间进行统计学分析.
1.2.7流式细胞仪检测分别取第3，19，32代未转染细胞和转染后第3，16代细胞进行检测.用2.5 g・L-1胰酶消化细胞，收集1×105的细胞，离心.1×PBS重悬细胞，离心，750 mL・L-1乙醇固定后送检.
2结果
2.1细胞克隆的分离转染了psv3neo质粒的人正常皮肤成纤维细胞，在加G418后第3日开始出现死亡，第6 日未转染细胞全部死亡，转染组的阳性细胞继续存活.G418降至0.2 g・L-1维持筛选，2 wk后出现阳性克隆.滤纸片转移后， 进行扩大培养.
2.2光镜观察体外培养的皮肤成纤维细胞光镜下观察（Fig 1），正常状态时(第3， 19代)， 细胞体较小，细胞呈梭形，少分支，细胞边缘光滑.当细胞处于衰老期时（第32代），胞体变大，扁平，分支增多.转化初期(即转染后第3代)的细胞，胞体较正常细胞大、而且长，但较为规则.转染后第16代的成纤维细胞，胞体细长，常见单支状突起，胞核明显，胞质中颗粒增多.
A：P3 normal fibroblasts；B：P32 normal fibroblasts；C：P16 transformed fibroblasts.
图1相差显微镜下不同时期体外培养的皮肤成纤维细胞（略）
Fig 1Skin fibroblasts of different passage cultured in vitro by phase contrast microscorpe×100（略）
2.3原位杂交原位杂交检测得到，未转染细胞中无阳性表达，转染后第3，16代细胞胞质蓝色，呈阳性表达，胞核无表达或弱表达（Fig 2），说明LT cDNA已被稳定转入成纤维细胞中.
2.4免疫组织化学对转染后第3，16代细胞进行SV40大T抗原检测，胞质均呈棕黄色阳性表达，胞核则无着色（Fig 3）.
2.5生长曲线细胞生长曲线显示，正常培养条件下，从第19代开始细胞的增殖速度逐渐变慢，直至第32代左右，细胞已经出现衰老状态.转染后第3代成纤维细胞增殖较快，明显快于同期的未转染第19代细胞，甚至超过了正常第3代成纤维细胞.而转染后第16代成纤维细胞，增殖最为缓慢，速度明显低于与之相对应的未转染第32代衰老细胞，基本处于停滞状态（Fig 4).
图2转染细胞原位杂交 （略）
Fig 2In situ hybridization of transfected cellP3 transformed fibroblasts×400（略）
图3转染细胞免疫组化结果（略）
Fig 3Result of immunocytochemistry of transfected cellP3 transformed fibroblasts×100（略）
■: p3 transformed cells; ▲: p3 normal cells; ●: p19 normal cells; ○: p32 normal cells; : p16 transformed.
图4成纤维细胞生长曲线（略）
Fig 4Growth curve of fibroblasts（略）
2.6BrdU检测细胞增殖活性从强到弱依次为转染第3代细胞、未转染第3代成纤维细胞、未转染第19代成纤维细胞、未转染第32代成纤维细胞和转染第16代成纤维细胞.阳性率分别480±2.0，350±2.8，230±1.9，190±2.0，20±0.6(P&<0.05).
2.7流式细胞仪检测反应细胞增殖活力的增殖指数PrI从高到低为转染第3代细胞、未转染第3代成纤维细胞、未转染第19代成纤维细胞、未转染第32代成纤维细胞和转染第16代成纤维细胞(Tab 1)，与细胞生长曲线、BrdU所反映的结果完全一致.
表1SV40大T抗原对皮肤成纤维细胞增殖周期的影响 （略）
Tab 1SV40 large T on cell cycle period of skin fibroblasts（略）
3讨论
人的正常皮肤成纤维细胞体外培养时，分裂能力有限， 经过一定的时期后，它们就会进入一种生长抑制状态，即所谓的“衰老”(也称M1期)［３］ .永生化皮肤成纤维细胞的获得，不仅有助于我们发现和理解皮肤肿瘤发生的生物学规律，以及细胞的生理、分化机制，还有助于研究皮肤衰老现象发生的机制，为我们攻克肿瘤，研究干细胞的特性，控制细胞的增殖分化等许多方面的研究奠定坚实的基础. 同时，永生化的皮肤成纤维细胞在体外可多次传代，具有相对稳定的增殖特性和功能状态，将其作为细胞工程和组织工程等研究领域的标准细胞，有助于体外实验的标准化.通过基因转染可使正常哺乳动物细胞长期培养，甚至发生永生化的改变，故该技术被广泛应用于哺乳动物细胞复制和基因表达研究的实验模型.其中SV40，是较为常用且有效的体外细胞转化因素之一.
本实验利用脂质体介导的基因转染技术，分离获得了由SV40大T抗原转染、增殖较为旺盛的皮肤成纤维细胞.免疫组化及原位杂交证实，转染细胞胞质中有大T抗原及其mRNA的表达，说明LT抗原基因已经稳定转染到了细胞中.细胞生长曲线、BrdU、流式细胞仪的检测都证明了在转染后的一段时间内，细胞的生长速度明显加快. 提示细胞在转染后这一时期内，增殖速度的提高与LT的表达密切相关.但LT并不能使人正常皮肤成纤维细胞发生永生化改变.在转染后第16代，细胞逐渐进入“危机”状态，停止增殖并出现死亡.说明LT只能发挥短暂的促进成纤维细胞增殖的作用. 而同一时期的衰老细胞，仍能以缓慢的速度保持生长，未出现明显的细胞死亡.推测危机的启动可能是由于LT的功能发生了改变，诱导了细胞的增殖抑制，甚至死亡. 这一现象是否与近年来研究的与细胞生命周期最为密切的端粒的变化有一定的关系，还是存在其他原因？有待进一步研究.
永生化的皮肤成纤维细胞系的获得，对于各种皮肤疾病以及皮肤组织工程的研究具有重要意义，但是上述研究结果表明要得到永生化的皮肤成纤维细胞，仅仅依靠SV40大T抗原的转化是不足的，还需要结合其他的因素，如端粒酶的激活等或开辟其他的途径.
【参考文献】
［1］Pignolo RJ，Rotenberg MO，Cristofalo，VJ. Alterations in contact and densitydependent arrest state in senescent WI38 cells［J］. In Vitro Cell Dev Biol Anim， 1994;30A(7):471-476.
［2］ E Zheng. Tissue culture and Molecular Techniques［M］. Beijing: Beijing Publication， 1997：121-129.
［3］ Matsumura T， Zerrudo Z ，Hayflick L. Senescent human diploid cells in culture: survival， DNA synthesis and morphology［J］. J Gerontol， 1979;34(3):328-334.
［4］Fanning E，Knippers R. Structure and function of simian virus 40 large tumor antigen［J］.Annu Rev Biochem， 1992;61:55-85.
［5］Bryan TM，Reddel RR.SV40induced immortalization of human cells［J］. Crit Rev Oncog， 1994;5(4):331-357.
［6］Su YJ，Chen B， Tang CW， Hu DH， Jiang DY， Jia CY. In vitro transformation of human keratinocytes by simian virus SV40［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)， 1999;20(5):382-385.
［7］Lubbe L， Rudolph M， Scherneck S， Zimmermann W， Geissler E. Immortalization of human LeschNyhanfibroblasts following infection with Simian virus 40［J］. Arch Geschwulstforsch， 1983;53(2):105-113.
［8］Su YJ，Chen B， Jia CY， Tang CW. Biological characteristics of longterm in vitro culture of SV40 transformed human keratinocyte line ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)， 1999;20(5):386-388.
［9］Lustig AJ. Crisis intervention: the role of telomerase［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1999;96(7):3339-3341.
［10］MaceraBloch L， Houghton J， Lenahan M， Jha KK， Ozer HL.Termination of lifespan of SV40transformed human fibroblasts in crisis is due to apoptosis［J］. J Cell Physiol， 2002;190(3):332-３44.
［11］Toouli CD， Huschtscha LI， Neumann AA， Noble JR， Colgin LM， Hukku B， Reddel RR.Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 Tantigen or by the telomerase catalytic subunit［J］. Oncogene， 2002;21(1):128-１39.
［12］Chen SL， Tsao YP， Chen YL， Huang SJ， Chang JL， Wu SF. The induction of apoprosis by SV40 T antigen correlates with cjun overexpression［J］. Virology， 1998;244(2):521.转贴于