作者：李锋，王汉民，行利，王长海，程庆砾，叶传蕙
【关键词】 肾康注射液
【Abstract】 AIM: To explore the mechanism of ShenKang Injection (SKI) on prohibiting glomerulosclerosis (GS) so as to provide fresh evidence for clinical application of SKI in treating chronic renal failure (CRF). METHODS: Using serumpharmacological test of Chinese herbs， the effects of SKI on the proliferation in cultured human glomerular mesangial cells (GMC) and the level of fibronectin (FN) secretion in cultured GMC were observed. RESULTS: SKI and serum with SKI significantly inhibited the proliferation and the level of secreting FN in cultured GMC in a concentrationdependent manner (P&<0.01， P&<0.05). With the prolonging of stimulating time， the inhibitory effects SKI increased on the proliferation and the level of FN， but the effects of serum with SKI decreased on the proliferation and the level of FN. CONCLUSION: The effects of SKI on GMC differ from those of serum with SKI. It is indicated that the effective mechanism of SKI is complicated and is related to SKI metabolism.
【Keywords】 Shenkang injection; glomerular mesangial cell; fibronectin
【摘要】 目的： 探讨肾康注射液（SKI）阻抑肾小球硬化（GS），防治慢性肾功能衰竭（CRF）的部分作用机制，为SKI临床应用提供依据. 方法： 采用血清药理学实验法，观察SKI对体外培养人肾小球系膜细胞（GMC）增殖及其自分泌纤维连接蛋白（FN）水平的影响. 结果： SKI及其含药血清对GMC增殖、自分泌FN有明显抑制作用（P&<0.01， P&<0.05），呈剂量或SKI血药浓度与效应依赖性；但随刺激时间延长，其作用存在差异，即对增殖的抑制效应：SKI呈递增趋势、而SKI含药血清则呈递减趋势，对FN水平的抑制效应则相反. 结论： SKI经机体代谢，药理效应的不一致性，提示SKI含药血清可能出现提高FN降解酶活性的新物质，或存在降解FN的某种活性成分.
【关键词】 肾康注射液；肾小球系膜细胞；纤维连接蛋白
0引言
肾康注射液(Shenkanginjection，SKI)为纯中药复方制剂，具有“降逆泻浊、益气活血”功效，研究显示：SKI对肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell， GMC）的增殖及自分泌IL1有明显抑制作用. 但SKI含药血清对GMC增殖及其自分泌纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)水平影响如何未见报道. 我们的实验初步揭示SKI及其含药血清对GMC的效应异同，为该制剂临床应用提供初步依据.
1材料和方法
1.1材料SKI：20 mL/支(含生药量6 g，批号：970718），成都中医药大学附属医院肾病研究室提供；肝素钠注射液：购于解放军总医院药剂科；雄性Wistar大鼠8只，体质量（230±20） g，购于解放军总医院实验动物中心；肾组织来源：配型不符的成人移植肾；有关GMC培养和FN检测试剂及器械由解放军总医院肾内科实验室提供.
1.2方法新鲜肾组织用无菌4℃生理盐水冲洗，剪肾皮质成碎块，入上层筛网（孔径250 nm），针芯轻压并冲洗肾组织入中层网(106 nm)、继续轻研并冲洗组织碎屑入下层网(75 nm)，收集此层组织悬液镜下观察为纯净肾小球（98%）、即停止冲洗，移入离心管离心（800 r・min-1） 3 min，弃上清，加入100 g・L-1 V型胶原酶2~3 mL混匀、置37℃孵育箱消化15~20 min，至肾小球包曼囊剥离、细胞散出，用100 g・L-1 FCS+RPMI 1640终止消化，离心（800 r・min-1）2~5 min，弃上清，将沉淀混匀加GMC培养液，入37℃，50 mL・L-1 CO2孵育箱中培养. GMC鉴定［1］用抗结蛋白和抗细胞角蛋白抗体进行间接免疫荧光染色，结果示：抗结蛋白为阳性，胞质中可清楚见中间微丝结构，抗细胞角蛋白和Ⅷ因子相关抗原为阴性，证实为GMC. SKI含药血清制备：Wistar大鼠8只，随机分为SKI低(L)、中(M)、高(H)剂量组和正常组各2只；按SKI临床推荐用量(0.5 g・kg-1)的2，4，8倍作本实验的L，M，H剂量，分别为：3.5， 7.0和14.0 mL・kg-1，鼠尾静脉注射给药，每日1次、共7 d；正常组动物同时同法给生理盐水7 mL・kg-1；大鼠活动、进食良好. 第7 日给药后2 h，眼球采血，无菌分离血清，56℃水浴30 min并滤菌，置-20℃保存备用. 取第3代GMC植入96孔平底培养板(细胞密度5×103/孔)，37℃， 50 mL・L-1 CO2培养箱中培养24 h；弃上清、加无血清RPMI 1640同步24 h；分组：SKI低、中、高剂量组（5 g・L-1， SKIL， 10 g・L-1， SKIM， 20 g・L-1， SKIH)和培养基组（Baseline），SKI低、中、高剂量含药血清组（SKILS， SKIMS， SKIHS）和血清组（Serum）；分别于刺激培养12， 24， 36， 48和60 h收集细胞上清；细胞增殖检测用MTT比色法［2］、FN检测用双抗体夹心ELISA法［3］；用SPSS软件进行重复测量资料的方差分析.
2结果
2.1SKI对体外培养GMC增殖的影响Baseline组GMC保持平稳增殖趋势，而SKI不同剂量对GMC的增殖均有明显抑制作用，随时间延长，药物剂量加大，抑制作用增强（P&<0.05），呈剂量依赖关系（Fig 1）.
◆: Baseline; □: SKIH; △: SKIM; ○: SKIL.
图1SKI对体外培养GMC增殖的时间效应变化（略）
Fig 1SKI on cultured glomerular mesangial cells（略）
2.2SKI含药血清对体外培养GMC增殖的影响不同时间点，Serum组GMC增殖明显，与Baseline组比较有非常显著性差异（P&<0.01）；12， 24和36 h， SKI含药血清明显抑制GMC的增殖，呈剂量依赖性，以36 h为抑制效应高峰；在36， 48 h其抑制作用逐渐减弱；在60 h抑制作用消失，并显示促增殖作用(P&<0.05， Fig 2）.
◆: Baseline; ×: Serum; □: SKIHS; △: SKIMS; ○: SKILS.
图2 SKI含药血清对体外培养GMC增殖的时间效应变化（略）
Fig 2SKI serum on cultured glomerular mesangial cell（略）
2.3SKI对体外培养GMC自分泌FN水平的影响SKI3剂量对GMC自分泌FN有明显抑制效应(P&<0.05， 0.01)、呈剂量依赖性，随刺激时间延长抑制效应呈减弱趋势（Fig 3）.
◆: Baseline; □: SKIH; △: SKIM; ○: SKIL.
图3SKI对体外培养GMC自分泌FN水平的时间效应变化（略）
Fig 3Fibronectin secretion in cultured glomerular mesangial cells with SKI（略）
2.4SKI含药血清对体外培养GMC自分泌FN水平的影响SKI含药血清对GMC自分泌FN水平有明显抑制作用（P&<0.01)、呈剂量依赖性；在12，24和36 h对FN的抑制效应可能与SKI含药血清抑制GMC增殖有关，在60 h，SKI含药血清促进GMC增殖，但对GMC自分泌FN的抑制作用依然存在且有显著差异(P&<0.01)，说明SKI体外直接加药与其含药血清对GMC增殖、自分泌FN效应存在差异，提示SKI含药血清可能出现促进FN降解的新效应成分（Fig 4）.
图4SKI含药血清对GMC自分泌FN抑制作用时间效应（略）
Fig 4Fibronectin secretion in cultured glomerular mesangial cell with SKIserum（略）
3讨论
SKI由大黄、黄芪等制成的中药复方静脉制剂，可直接加药进行体外实验，亦应选用血清药理学方法，观察SKI经机体代谢后，其成分或代谢产物对GMC之效应，此更能反映或接近SKI在体内所产生的药理效应实际. 研究表明：大黄蒽醌、大黄酸蒽醌酮葡萄糖甙直接抑制GMC生长，大黄衍生物的血清亦明显抑制GMC的DNA和蛋白质合成，有利于减轻GMC病理性增生，减缓肾组织硬化进程［4］；川芎嗪亦抑制GMC增殖［5］. 以上研究为观察SKI及其含药血清对GMC增殖的影响提供了可靠依据.
本实验初步显示：SKI抑制体外培养GMC的增殖并呈剂量依赖性，效应从刺激12 h始、延续至60 h，呈递增趋势；SKI含药血清对GMC增殖的抑制效应与SKI血药浓度有量效依赖性，效应强度随刺激时间延长呈递减趋势，提示SKI及其含药血清可明显减缓GMC增殖，但效应不同.
FN是一种始动因素，可能诱导Ⅳ胶原的形成、促进GS［6］，FN在病变早期主要来源于血浆，中、后期为肾小球局部合成，其中以GMC为主. 本实验显示：SKI可明显抑制GMC自分泌FN的水平，呈现剂量、 时间 依赖性，说明SKI抑制了ECM生成或积聚的始动因素，阻止ECM堆积，防止GS发生. ECM含有Ⅳ， Ⅴ， Ⅵ型胶原和FN、纤维连接蛋白、内动蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖等成分，不含间质胶原（Ⅰ， Ⅲ型胶原）. ECM的堆积，一是合成增加、二是降解减少，当肾小球ECM的合成与降解有利合成时，则出现ECM的堆积. SKI含药血清在不同时间点对GMC自分泌FN均有明显抑制作用，这一抑制作用可能与SKI内含大黄素、黄芪甲甙等有效成分有关，在60 h，SKI含药血清对GMC增殖无抑制作用，但对其自分泌FN的抑制作用依然存在，且3剂量组间有显著性差异（P&<0.05），与对照组亦有显著性差异(P&<0.01).
说明SKI经体内代谢，其含药血清可能出现提高FN降解酶活性的新物质，或产生降解FN的某种活性成分，有待今后研究证实.
【参考文献】
［1］ Yu LF， Chen XM， Li LS. Investigation of human glomerular mesangial cell in culture ［J］. Zhonghua Shenzangbing Zazhi （Chin J Nephrol），1990;6（2）:70.
［2］ Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assay ［J］. J Immu Methods，1983;65:55-64.
［3］Nahman NS， Leonhart KL， Cosio FG， Hebem CL. Effects of high glucouse on cellular proliferation and fibronectin production by cultured human mesangial cells ［J］. Kid Int， 1992;41:396-402.
［4］Jiang GW， Chen XM， Li LSH. Study of invitro effects of Rhubarb on rat mesangial cell growth ［J］. Zhonghua Shenzangbing Zazhi （Chin J Nephrol），1990;6（3）:133-136.
［5］ Sun L， Yi ZW， Yu PL. Effects of Tetramethylhyrazine of human fetal mesangial cells ［J］. Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Zazhi（Chin J Integ Trad West Med）， 1995;15（3）:134-135.
［6］ Zhang Y. Study of the relationship between fibronectin and sclerosis of renal glomeruli ［J］. Zhonghua Binglixue Zazhi（Chin J Pathol）， 1987;16（1）:36-38.