作者：李静，杨守京，刘彦仿，周鹏，韩骅
【关键词】 热休克蛋白70
【Abstract】 AIM: To construct the bait vector (pGBKT7Hsp70) of MATHMAKER GAL4 TwoHybrid System 3， and test it for its autonomous activation. METHODS: Hsp70 gene was amplified by PCR from pBBS212Hsp70 plasmid， and the EcoRI and BamHI sites were introduced into it. The Hsp70 gene， after sequenced， was cloned into pGBKT7. Selfactivation of the recombination vector (pGBKT7Hsp70) was tested. RESULTS: The pGBKT7Hsp70 vector was successfully constructed and had no autonomous activation. CONCLUSION: The pGBKT7Hsp70 was proved to be suitable for further research on the genes in tumors， which interact with the Hsp70.
【Keywords】 Hsp70; yeast two hybrid system; autonomous activation
【摘要】目的：构建用于酵母双杂交系统的“诱饵”载体pGBKT7Hsp70，并检测其是否具有自激活作用.方法：用PCR的方法从质粒pBBS212Hsp70中扩增出Hsp70基因片段，引入酶切位点EcoRⅠ，BamHⅠ.测序正确后，将Hsp70基因克隆至载体pGBKT7中，并检测pGBKT7Hsp70在MATHMAKER GAL4 TwoHybrid System 3中的自激活作用. 结果： 成功构建了“诱饵”载体pGBKT7Hsp70，并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用. 结论： pGBKT7Hsp70可以用于酵母双杂交系统中，寻找与Hsp70相互作用的分子.
【关键词】 热休克蛋白70；酵母双杂交系统；自激活作用
0引言
热休克蛋白（heat shockproteins， HSPs）是广泛存在于生物体内的一类高度保守的蛋白质，它参与蛋白质的合成、折叠、装配及转运，是细胞生存所必需的，且也是肿瘤细胞生存所必需的. 反义hsps转染，可导致肿瘤细胞生长停滞或死亡［1-3］. 热休克蛋白70（HSP70）是目前研究得较为深入的一个家族，与肿瘤的发生发展及预后关系密切. 为寻找与HSP70相互作用的蛋白，并查明他们的相互作用位点及其体内外结合特性，我们拟采用酵母双杂交系统进行研究，构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7HSP70，并转化酵母菌AH109，观察其是否具有自激活作用.
1材料和方法
1．1材料质粒pBBS212Hsp70， DH5a菌种均为本室保存. 酵母菌AH109为遗传与发育教研室保存.
DNA重组的各种限制性内切酶，pMD18Tvector，T4 DNA Ligase 及PCR反应系统的LA Taq DNA聚合酶，dNTP ，10×PCR缓冲液，MgCl2分别购自TaKaRa公司. 酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7，酵母培养试剂购自Clontech公司.
1．2方法
1．2．1构建诱饵载体(pGBKT7Hsp70)以质粒pBBS212Hsp70为模板，用PCR的方法扩增出目的基因Hsp70.
引物设计如下：3′GGGGATCCCTAATCT
ACCTCCTCAATGGT；5′GCGAATTCGCAGCTGCAATG
GCCAAAGCCGCGGCGGCGAT;分别在两端引入酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ. 反应总体积为50 μL，其中包括：Primer 5′ 0.1 mmol，Primer 3′ 0.1 mmol， 10 xbuffer 5 μL， 2.5 mmol・L-1 dNTP 4 μL， pBBS212Hsp70 50 ng， LA Tag 0.5 μL， h3O 38 μL. 反应程序为：95℃预变性5 min后， 95℃ 1 min， 55℃ 1 min， 72℃ 1 min，循环30次，最后72℃ 10 min.
将获得的PCR产物电泳，胶回收后，克隆至载体pMD18Tvector中. 酶切鉴定后，送往上海生工测序. 测序正确后，用EcoRⅠ， BamHⅠ酶切pMD18TvectorHsp70和载体pGBKT7. 酶切产物电泳，胶回收目的片断和载体，通过连接，转化，构建诱饵载体(pGBKT7Hsp70).
1．2．2制备酵母感受态将酵母菌AH109菌种划线接种于YPDA平板上. 30℃孵育2～3 d后，沿划线长出白色克隆. 挑取2～3个克隆，接种于5 mL YPD液体培养基中，30℃，250 r・min-1 震荡培养16～18 h，至A 600&>1.5. 将该菌液按1∶10接种于10 mL YPD中，使其A 600=0.4～0.6，收菌5 mL，室温离心5000 r・min-1， 5 min， 弃上清，以5 mL去离子水重悬，即为酵母感受态细胞.
1．2．3以pGBKT7Hsp70转化酵母感受态取0.1 μg“诱饵”质粒pGBKT7Hsp70与0.1 mg鲱鱼精DNA混匀后，加入100 μL酵母感受态，轻混匀后，加入600 μL PEG4000/LiAc混和液，剧烈震荡混匀. 30℃震荡培养30 min后，加入70 μL DMSO，轻轻颠倒混匀，42℃热休克15 min，冰浴2 min， 5000 g， 离心5 s后去上清. 沉淀用100 μL TE重悬，涂布于营养缺陷平板SD/Trp上，30℃孵育.
1．2．4pGBKT7HSP70自激活检测待SD/Trp平板上长出克隆后，挑取单个克隆溶于10 μL去离子水中，分别划线接种于SD/Trp， SD/Ura， SD/ Leu， SD/His平板上，30℃孵育，观察其生长情况.
2结果
取4 μL PCR产物做0.1 g・L-1的琼脂糖电泳. 在2.0 kb处有一明亮的条带，与Hsp 70的大小一致(Fig 1). 测序结果显示，该PCR产物所含片段全长1926 bp. 5′端，3′端的酶切位点分别为EcoRⅠ和BamHⅠ. 经NCBI Blast比较，该序列与NM 005345.3 heat shock 70 ku protein 1A序列一致(Fig 2) . 将测序正确的Hsp70基因用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，克隆至载体pGBKT7中，构建诱饵载体pGBKT7Hsp70，并用相同的酶进行酶切鉴定(Fig 3). pGBKT7Hsp70转化AH109，铺于SD/Trp平板上， 30℃孵育3 d后，可见约1 m3大小的白色克隆出现. 挑4个单个克隆划线接种于SD/Trp， SD/Ura， SD/Leu和SD/His平板上， 30℃，孵育5～7 d.在SD/Trp，SD/Ura平板上沿划线长出白色克隆，在SD/Leu， SD/His平板上无克隆出现. 说明pGBKT7Hsp70没有激活Leu基因和His基因的报告，即无自激活作用(Fig 4).
3讨论
本实验成功地构建了用于酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7Hsp70，并证明其在该系统中没有自激活作用.
1: Gene RulerTM 1000 bp DNA Ladder (MBI); 2: PCR product.
图1PCR产物电泳（略）
Fig 1PCR product（略）
图2测序峰值图（略）
Fig 2Result of sequence（略）
M: Gene RulerTM 1000 bp DNA Ladder (MBI). 1: pGBKT7Hsp70 digested by EcoRⅠ and BamHⅠ; 2: Plasmid pGBKT7.
图3重组“诱饵”载体酶切鉴定（略）
Fig 3Identification of recombination vector （pGBKT7Hsp70）（略）
HSPs是细胞在受到缺氧、氧化损伤、病毒感染、免疫紊乱等各种应急状态导致损伤时，为适应周围微环境改变而暂时性上调的一类蛋白质［4］. 在越来越多的肿瘤组织中发现有HSPs的高表达［5］. 其中Hsp70具有分子伴侣的作用，能结合细胞中的各种蛋白分子，包括多种癌基因产物（如Raf， VSrc， Rb， p53等），形成异源蛋白复合体，介导癌基因的构象成熟及转运，保护其不被降解，延长半衰期，从而参与肿瘤的发生发展. 大量文献报道，Hsp70家族与突变或野生型p53结合在调控p53功能方面起着重要作用.
在乳腺癌、口腔癌组织中已证实存在Hsp70p53复合物［4］. A: SD/Trp; B: SD/Ura; C: SD/Leu; D: SD/His.
Fig 4Autonomous activation of pGBKT7Hsp70（略）
人原发性肝癌是我国常见的、严重危害人类生命的恶性肿瘤之一.
我们先前的实验用免疫共沉淀的方法亦证实了在肝癌组织中，Hsp70p53复合物的存在. 但HSPs在肝癌发病机制中的作用和意义仍然不清.
Srivastava等［6，7］认为，在肿瘤组织中Hsp70结合了肿瘤细胞中多种抗原多肽. 用肿瘤组织中提取的Hsp70多肽复合物免疫同系动物，可诱导其产生对同类型肿瘤的特异性细胞免疫反应［8，9］. 但仍未解决在研制肿瘤特异性疫苗的过程中，长期困扰人们的一个问题：寻找肿瘤的特异性抗原. 肿瘤特异性抗原是肿瘤免疫治疗的关键，而已经明确的肿瘤抗原极少又是限制有效的抗瘤免疫反应的一个主要因素. 理论上，肿瘤细胞内任何在质和量上与正常细胞不同的蛋白质都可能是肿瘤抗原. 纯粹的肿瘤特异性抗原最初认为具个体特异性，但近年来的研究已经证实一些CTL能够以MHC限制性的方式杀伤异体肿瘤细胞，表明存在着共同的肿瘤相关抗原［10］. 大多数人体肿瘤均存在肿瘤细胞特有的原癌基因突变或过度表达，而且CTL细胞能够识别这种突变［11］. 因此，突变或过度表达的原癌基因成为靶向性肿瘤免疫治疗的新热点. 那么，在肝癌组织中Hsp70多肽复合物中究竟有哪些肿瘤抗原分子与Hsp 70相互结合呢？明确这些抗原分子，对于今后肿瘤疫苗的研究将具有十分重要的意义. 因此，我们将Hsp70构建于pGBKT7载体中，构建酵母双杂交系统中Hsp70与DNAbindingdomain融合表达的“诱饵”质粒pGBKT7Hsp70，以期从人肝癌的cDNA文库中钓到与之相互作用的基因. 在应用酵母双杂交系统研究相互作用之前，首先要排除“诱饵”蛋白的自激活功能，否则就大大增加假阳性结果. 本实验利用不同营养缺陷的SD平板进行验证，结果表明Hsp70无自激活功能. 所以可利用此系统来寻找与Hsp70相互作用的蛋白. 载体构建成功且无自激活功能，为下一步的筛选试验奠定了基础.
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