【关键词】 冰片
【Abstract】 AIM: To develop a new method for determining the borneol content in traditional Chinese medicine. METHODS: By precolumn derivatization with 3， 5dinitrobenzoyl chloride（DNBCl， approximately 20 times the mole ratio of borneol） catalyzed by 4dimethylaminopyridine（DMAP， approximately 40 times the mole ratio of borneol） in acetonitrile at room temperature，the reaction mixtures were injected into and separated on an ODS column with methanol∶water（88∶12） as mobile phase， and detected at 225 nm. RESULTS: The calibration curve was linear in the range of 1 ~ 10 nmol for borneol. The borneol contents of two batches of LaoMaiKang were 7.9% and 7.1% and RSD was 1.0% and 1.5% (n=5)， respectively. The average recovery rate was 99.9% and RSD is 1.8% (n=4). CONCLUSION: HPLC derivatization method is simple and accurate for the determination of borneol content in traditional Chinese medicine.
【Keywords】 borneol; HPLC; derivatization; borneyl 3，5dinitrobenzoate
【摘要】 目的： 建立一种测定脑脉康中冰片含量的新方法. 方法： 柱前衍生化在乙腈中反应，以3， 5二硝基苯甲酰氯为衍生化试剂（与冰片的摩尔比为20倍），4二甲氨基吡啶为催化剂（与冰片的摩尔比为40倍）. 然后在ODS柱上，以甲醇∶水（88∶12）为流动相，检测波长225 nm，高效液相色谱测定脑脉康中冰片含量. 结果： 冰片在1～10 nmol范围内，色谱峰面积与进样量呈线性关系（R2=0.9996， P&<0.01). 两批脑脉康中冰片的含量分别为7.9%和7.1%， RSD分别为1.0%和1.5%(n=5). 平均回收率为99.9%，RSD为1.8%(n=4). 结论： 高效液相色谱衍生化法用于测定脑脉康中的冰片含量方法简便、准确、可行.
【关键词】 冰片；高效液相色谱法；衍生化; 3，5二硝基苯甲酸冰片酯
0引言
冰片具有通诸窍，散郁火，消肿止痛之功能，常用于内服及外用中成药中. 有关冰片的含量测定方法，由于冰片化学结构无特征紫外吸收，因此主要采用薄层扫描法和气相色谱法［1］. 高效液相色谱仪是实验室常见分析仪器，适用于常见中成药成分的分离和测定［2-4］，但紫外吸收弱的化合物直接检测较为困难. 根据冰片结构中含羟基的特点，3，5二硝基苯甲酰氯可作为此类化合物的衍生化试剂［5］，在叔胺或吡啶类化合物的催化下可和冰片反应生成具强紫外吸收的3，5二硝基苯甲酸冰片酯. 我们利用此原理以反相HPLC法对脑脉康中冰片含量进行了测定方法学研究.
1材料和方法
1.1材料高效液相色谱仪配备紫外检测器（日本岛津LC10Avp），色谱柱：Kromasil C18 150.0 mm×4.6 mm， 5 μm(大连伯瑞公司填充). 冰片对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号7438902），溶于乙腈中制成浓度为1 mmol・L-1的溶液；3，5二硝基苯甲酰氯（DNBCl，北京化工厂），溶于乙腈中制成浓度为5 mmol・L-1的溶液；4二甲氨基吡啶（DMAP， Sigma公司），溶于乙腈中制成浓度为40 mmol・L-1的溶液. 3，5二硝基苯甲酸冰片酯（自制，mp: 148～150℃），乙腈（色谱纯），甲醇（分析纯）. 脑脉康肠溶胶囊（自制，批号20010319， 20010426）.
1.2方法
1.2.1色谱条件以甲醇：水（88：12）为流动相，流速1.0 mL・min-1，检测波长225 nm，进样体积5 μL的色谱图（Fig 1）.
1.2.2衍生反应温度和时间考察经试验发现反应温度(20～80℃)对衍生反应无明显影响. 在室温下，混合2 min后衍生反应即可完成.
1.2.3DNBCl用量选择将冰片和DMAP用量固定，改变衍生化试剂DNBCl的用量（Fig 2）.
实验表明当DNBCl与冰片的摩尔比(nDNBCl/nborneol)为35倍时，衍生物相对色谱峰面积最大，但放置稳定性稍差，而摩尔比为20倍时放置稳定性较好，因此正式实验选择DNBCl与冰片的摩尔比为20倍.
图13，5二硝基苯甲酸冰片酯(A)、缺冰片之脑脉康(B)、冰片对照品（C）、脑脉康（D）衍生反应后色谱图（略）
Fig 1HPLC chromatograms of borneyl 3， 5dinitrobenzoate(A)，derivatized NaoMaiKang excluding borneol(B)， derivatized standard borneol （C）， derivatized NaoMaiKang sample（D）（略）
图2DNBCl用量对衍生反应的影响（略）
Fig 2Effect on derivatization of the DNBCl/borneol mole ratio（略）
1.2.4DMAP用量选择将冰片和DNBCl用量固定，改变催化剂DMAP的用量（Fig 3）. 实验表明当DMAP与冰片的摩尔比(nDMAP/nborneol)为20倍时，衍生物相对色谱峰面积最大，而摩尔比为40倍时，适应范围较宽，因此正式实验选择DMAP与冰片的摩尔比为40倍.
Fig 3Effect on derivatization of the DMAP/borneol mole ratio（略）
1.2.5对照品和供试品溶液的衍生化制备定量吸取冰片对照品溶液100 μL置具塞试管中，加入400 μL DNBCl溶液，再加入100 μL DMAP溶液混匀，即得. 精密称取脑脉康药粉约42 mg于25 mL容量瓶中，加适量乙腈，旋涡振荡，加乙腈至刻度，混匀，转入离心管中离心（14 000 g・min-1） 5 min，取100 μL同对照品溶液衍生化制备方法进行.
2结果
2.1线性关系分别精密吸取对照品溶液的衍生化溶液1，2，3，4，5，6，7，8，9和10 μL注入色谱仪，以进样体积（X）对色谱峰面积（Y）进行线性回归， 得回归方程为： Y=-14.6+82796.4X， R2=0.9996 (P&<0.01). 因此在1～10 nmol范围内，冰片衍生物色谱峰面积与进样量成正相关.
2.2加样回收率试验精密称取已知含量的脑脉康药粉适量，加入一定量的对照品溶液，按“1.2.5”项下处理，测定含量，计算脑脉康中冰片的回收率为99.9%，RSD为1.8%(n=4).
2.3样品测定结果将对照品和供试品衍生化后溶液各5 μL分别注入色谱仪，测定峰面积，按外标法计算，测得两批脑脉康中冰片的含量分别为7.9%和7.1%， RSD分别为1.0%和1.5%(n=5).
3讨论
冰片是一味常用的中药，有合成和天然之分，主要成分是互为异构体的龙脑和异龙脑. 其化学结构无特征紫外吸收，无法直接用实验室常见分析仪器高效液相色谱仪进行含量测定，因此采用衍生化HPLC法是测定这类化合物较好的方法. 冰片结构中含羟基，而3， 5二硝基苯甲酰氯是羟基化合物常用的衍生化试剂，在叔胺或吡啶类化合物的催化下可和冰片反应生成3， 5二硝基苯甲酸冰片酯，该新化合物具有较强的紫外吸收，龙脑和异龙脑在此色谱条件下显示为单峰，从而利用柱前衍生化反相HPLC法间接完成了脑脉康中冰片含量的测定研究.
实验中曾使用三乙胺作为催化剂，发现即使升高反应温度，三乙胺对衍生反应的催化作用也较弱. 使用乙腈作衍生反应和提取溶剂，需注意其含水量的大小，如含水分大，需经脱水处理. 冰片的DNBCl衍生物3， 5二硝基苯甲酸冰片酯在225nm处有很强的紫外吸收，因此选择225 nm为检测波长. 在本文的色谱流动相和流速条件下，出峰时间为5 min左右，较合适于样品的快速测定. 在所选择的DNBCl， DMAP和冰片比例下，衍生物性质较为稳定，8 h内测定样品峰面积基本无变化. 本方法采用的衍生化反应条件简单，衍生化产物稳定，样品前处理容易，具有较好的线性关系和回收率，有可能也适用于其他含冰片中成药的质量控制.
参考文献
［1］ Zheng HZ， Dong ZH， She J. Modern Research and Application of Chinese Traditional Herbal Drugs ［M］. Vol 2.Beijing: Xueyuan Press， 1997: 1980-1994.
［2］ Wang XJ， Zhu LZ， Wang SW， Wang JP. Preparation process of optimizing Pingzhi capsules with orthogonal test ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)， 2000;21(2):235-237.
［3］ Cheng XF， Zhao L， Wang FP， Wen AD， Jiang YP， Li ZY， Huang P. Determination of tanshinone A in jiangnian kangshuan tablets by HPLC ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)， 1999;20(4):363-364.
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［5］ Li FM. HPLC Technology in Medicine and Pharmaceuticals ［M］. Beijing: Renmin Weisheng Chubanshe (Peoples Health Publishing Press)， 1997:68.