关于活血化瘀中药复方诱导K562细胞凋亡

　　　　　　作者：郑瑾，刘强，王宗仁，李军昌，王文，马爱玲，马静，李晶华，肖铁卉

【关键词】 中药复方
　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of blood-activating and stasis-eliminating compound on the proliferation and apoptosis of human chronic myelocytic leukemia cell line K562 cells. METHODS: Living cells were counted by trypan-blue excluding and cell growth curve was drawn. Changes of cell morphology were observed by light and transmission electron microscopy. Flow cytometry (FCM) was used to determine cell apoptosis quantitatively. RESULTS: Chinese herbal compound inhibited the proliferation of K562 cells. The apoptosis of K562 cells was confirmed by FCM and typical ultrastructural changes. The apoptosis rate of 100 ml・L-1 drug serum was higher than that of 50 ml・L-1 drug serum (13.4%±1.3% vs 7.6%±0.9%， P&<0.01). CONCLUSION: Chinese herbal compound can inhibit the proliferation of human chronic myelocytic leukemia cell line K562 cells and induce the apoptosis of K562 cells.
　　【Keywords】 Chinese herbal compound; bloodactivating and stasiseliminating; apoptosis; K562 cell
　　【摘要】 目的： 研究活血化瘀复方对人慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞增殖、凋亡的影响. 方法： 通过台盼蓝拒染法活细胞计数，绘制细胞生长曲线. 光镜、透射电镜观察细胞形态学变化. 流式细胞检测定量观察细胞凋亡及其与药物的关系. 结果： 活血化瘀复方对K562细胞生长具有抑制作用，并且细胞呈现典型的凋亡形态学改变. 流式细胞检测显示药物血清作用6 h，K562细胞即已出现凋亡，100 mL・L-1含药血清组细胞凋亡率较50 mL・L-1含药血清组高(13.4±1.3)% vs (7.6±0.9)%， P&<0.01. 结论： 活血化瘀复方具有抑制白血病细胞生长，诱导白血病细胞凋亡的作用，从而为其临床应用提供了理论依据.
　　【关键词】 中药复方；活血化瘀；凋亡；K562细胞
　　0引言
　　慢性粒细胞白血病(CML)患者多有发热、贫血、乏力、衄血、肝脾肿大等症状，归属中医的“血症”、“虚劳”范畴，与瘀血有关，临床应用活血化瘀药物对CML治疗有较好疗效，患者生存质量提高［1］，但其作用机制少有报道. 我们从细胞凋亡角度探讨活血化瘀复方治疗CML的作用机制，为临床应用提供依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料新西兰家兔，雄性，体质量(2.0±2.5) kg (第四军医大学动物实验中心提供). 人CML细胞系K562细胞由唐都医院血液科实验室提供. 活血化瘀复方由大黄6 g，蛰虫6 g，莪术12 g，姜黄9 g，三七9 g，当归12 g，黄芪30 g，丹参12 g，党参20 g，甘草6 g，生地15 g，白花蛇舌草20 g组成，按常规方法煎煮浓缩成含生药1 kg・L-1，4℃保存备用. Annexin V FITC试剂盒购于Immunotech公司. 新西兰家兔8只，分为2组，每组4只. 实验组灌服活血化瘀复方制剂11 g・kg-1・d-1，对照组灌服等量生理盐水，连续灌药10 d，于最后一次灌药后2 h颈动脉放血，无菌分离血清，经56℃，30 min灭活处理后，0.45 μm 微孔滤膜过滤除菌，-20℃冻存备用. K562细胞常规培养于含100 mL・L-1小牛血清的RPMI 1640完全培养基(青霉素100 U・mL-1，链霉素100 U・mL-1，谷氨酸30 μg・mL-1)中，置CO2恒温培养箱(37℃， 50 mL・L-1 CO2，饱和湿度)中常规培养，2~3 d传代1次.

　　1.2方法取对数生长期细胞，去培养液. 分三组处理：对照组加入含100 mL・L-1正常兔血清的RPMI 1640培养液；实验组根据浓度又分为2组：100 mL・L-1含药血清组加入含100 mL・L-1含药兔血清的RPMI 1640培养液；50 mL・L-1含药血清组加入含50 mL・L-1含药兔血清 + 50 mL・L-1正常兔血清的RPMI 1640培养液. 调整细胞浓度为2×108・L-1，继续培养不同时间，收集各组细胞， 台盼蓝拒染法活细胞计数，绘制三组细胞生长曲线. 另外含药血清作用后不同时间倒置显微镜下观察细胞形态变化. 收集细胞，无菌PBS洗2次后离心涂片，WrightGiemsa混合染液染色，普通光镜观察. 另外收集细胞， 经25 g・L-1戊二醛前固定，10 g・L-1锇酸后固定，逐级丙酮脱水，EPON812包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅染色，JEM2000XE透射电镜下观察. Annexin V FITC/PI双标记法检测细胞早期凋亡操作按Annexin V FITC Kit说明书进行. 各组细胞培养6 h后收集，以冰冷的PBS洗涤1次，4℃， 500 g离心5 min，弃上清. 再用冰冷的结合缓冲液重悬细胞，将其浓度调整为1×108~1×109・L-1，取490 μL上述细胞悬液，加Annexin V FITC溶液及PI染液各5 μL，使其终浓度分别为1.0，2.5 mg・L-1，混匀， 避光冰浴10 min后，每组分别取8个样本行流式细胞仪检测.
　　统计学处理：采用SPSS 10.0 for windows统计学软件包，取x±s进行方差分析和LSD检验，以P&<0.05为显著性界限.
　　2结果
　　2.1复方中药对K562细胞增殖的影响对照组细胞一直处于增殖阶段而经不同浓度含药血清处理的K562细胞生长受到明显抑制，并呈现对浓度和时间的依赖性(Fig 1).
　　◆: Control; ▲: 50 mL・L-1; ●: 100 mL・L-1 drug serum.
　　图1复方中药对K562细胞增殖的影响（略）
　　Fig 1Effect of Chinese herbal compound on the proliferation of K562 cells（略）
　　2.2细胞凋亡的形态学观察经含药血清处理12 h后细胞形态逐渐发生变化. 倒置显微镜下观察，细胞先出现伪足，接着细胞体积缩小，细胞的折光性减弱消失，逐渐出现死亡. 光镜下可见细胞胞体缩小，胞膜完整，胞质中出现空泡，核染色质凝集，核固缩，核碎裂成多个微核并向胞膜周边聚集. 透射电镜下可见明显凋亡细胞(Fig 2)，其形态多样， 胞质浓缩，胞核固缩，异染色质边集成新月状或环状，但核膜完整，符合凋亡细胞形态学改变. 100 mL・L-1含药血清组细胞形态变化出现较早并且明显，而正常血清对照组细胞形态无变化.
　　图2复方中药对K562细胞超微结构的影响（略）
　　Fig 2Ultrastructure of K562 cells treated with 100 mL・L-1 serum containing Chinese herbal compound for 24 hEM ×4000（略）

转贴于 　2.3细胞早期凋亡率的流式检测在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外侧. 磷脂酰结合蛋白V（Annexin V）对PS具有高度的亲合力，故用荧光素FITC标记Annexin V检测PS，结合PI染色双标记法，可区分凋亡、坏死、活细胞3种状态的细胞. 结果显示含药血清具有诱导K562细胞凋亡的作用，50 mL・L-1含药血清组和 100 mL・L-1含药血清组凋亡率均高于对照组(7.6%±0.9%和13.4%±1.3% vs 2.3%±0.5%， n=8. P&<0.01). 100 mL・L-1含药血清组细胞凋亡率较50 mL・L-1含药血清组高（P&<0.05， n=8).
　　3讨论
　　CML中医辨证多为正虚瘀结，正虚则致脏腑功能失调，气血流通不畅，脉络瘀阻，气虚则唇甲少华，神疲倦怠，不思饮食，面色萎黄或黎黑，自汗、盗汗. 瘀血则积块坚硬，疼痛不移，肌肤甲错. 本方中党参、黄芪、甘草健脾益气以补虚，当归、三七、大黄、蛰虫等补血活血以化瘀，补虚则邪不可干，去瘀则新血可生，通过辨证论治，此方达到去邪扶正之功效.

　　本实验中，经含药血清处理的K562细胞生长受到明显抑制，并呈现对浓度和时间的依赖性，证实活血化瘀复方药物血清具有抑制K562细胞生长的作用. 经含药血清处理12 h后，K562细胞形态逐渐发生变化，透射电镜下可见明显凋亡细胞，从而从形态学证实活血化瘀复方药物血清具有诱导K562细胞凋亡的作用. 最后我们利用Annexin V FITC/PI双标记法细胞早期凋亡流式检测技术，不仅进一步证实活血化瘀复方药物血清作用6 h，K562细胞即已出现凋亡，并证实凋亡的发生与药物浓度有明显相关性.

　　中药复方是根据中医理论而制定的，在肿瘤治疗方面，对于深入阐明中医理、法、方、药之间相关性，阐明方剂君、臣、佐、使的关系，阐明中医辨证论治及整体观理论，更具有重要意义. 中药复方成分复杂，是多成分的混合物. 在本实验中，我们借鉴中药血清药理学实验方法［2］，这种方法排除了体外实验中，药物直接与细胞作用的各种干扰因素，较接近药物在体内环境中药理效应的真实过程. 尽管有文献报道复方药物致肿瘤细胞凋亡，但多为散结化痰、软坚消肿［3］，健脾补益［4-6］类方剂，而少有活血化瘀类药物报道. 我们揭示了活血化瘀复方具有抑制K562细胞生长，诱导其凋亡的作用. 但中药复方作用是多方面的，需要我们做进一步工作.
　　

参考文献

　　［1］ Wu SJ， Yan MX. Preliminary analysis about bloodactivating and stasiseliminating in clinical dialectic of chronic myelocytic leukemia ［J］. Zhongyiyao Xuekan (Study J Tradit Chin Med)， 2001;19(4):343-344.
　　［2］ Gao SL，Wang X，Chen XY. Study on Rabbits Serum with YiSuiLing Inducing the Apoptosis of HL60 Cells and Inhibiting the Expression of Bcl2 Gene ［J］. Zhongguo Zhongyi Jichu Yixue Zazhi (Chin J Bas Med TCM)， 2000; 6(8):27-29.
　　［3］ Zhang X， Liu DQ， Liu YZ， Wang P， Chen XY. Preliminary study on apoptosis of BEL7402 cells induced by chinese herbs for warming yang and dispersing stasis ［J］. Zhongguo Zongyao Zazhi (Chin J Chin Mater Med)， 2000; 25(7):428-430.
　　［4］ Zhou ZH， Song MZ， Yu EX， Zhu XZ. Effect of jianpiliqi formula on HAC mouse hepatic carcinoma cells by inducing apoptosis and upregulating the protein expression of bax gene ［J］. Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Piwei Zazhi (Chin J Intergr Tradit Western Med)， 2000;8(2):78-79.
　　［5］ Meng ZQ， Guo WJ， Yu EX， Song MZ， Huang WX. Inhibition of telomerase activity and induced apoptosis of liver cancer cell SMMC7721 by drug serum of JianpiLiqi herbs ［J］. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi (World Chin J Digestol)， 2000;8(8):879-882.
　　［6］ Zhao AG， Yang JK， Zhao HL.Chinese Jianpi herbs induce apoptosis of human gastric cancer grafted onto nude mice ［J］. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi (World Chin J Digestol)， 2000;8(7): 737-740.