作者：王立峰，张健，李莹，苏金，药立波，刘新平
【关键词】 基因表达
【Abstract】 AIM: To clone the coding sequences of human RD (regulation domain of PKB/Akt)， to express the corresponding protein and to get the purified protein. METHODS： The RD cDNA (regulation domain of PKB/Akt) fragment was amplified using PCR in fetal hepatocytes. The PCR product was then ligated into pMD18T vector. After sequence analysis， it was subcloned into pRSETA which can express the target protein as a (His)6tagged fusion. The bacterial strain BL21 (DE3) was used as the host cells to induce the expression of the fusion protein by IPTG. Cell pellets were lysed by sonication to get the supernatant. RESULTS: RD coding region was cloned into pRSETA and the sequence was confirmed by comparison with the published one. Recombinant pRSETARD was successfully constructed. RD/6×His fusion protein was correctly expressed and the purification was easily achieved on a Ni2NTA affinity column by virtue of the (His)6 tag on the protein. CONCLUSION： Human RD of akt1 gene has been successfully cloned and RD/6×His recombinant plasmid constructed. RD/6×His fusion protein has been correctly expressed in E.coli and the soluble fusion protein purified by Ni2NTA agarose beads.
【Keywords】PKB/AKT; cloning， molecular; gene expression; purification
【摘要】 目的： 克隆akt1的调节结构域 (regulation domain RD )的编码基因，表达并纯化 Akt RD蛋白，为研究 RD的功能奠定基础.方法： 用RTPCR方法从胚胎肝细胞中获得Akt1调节结构域RD的编码基因，克隆至pMD18T载体并测序，结果正确后亚克隆到含有6个His的融合表达载体pRSETA中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达RD/6×His融合蛋白，超声裂菌，将上清通过金属螯合层析进行纯化.结果： 从人胚胎肝细胞中扩增出编码RD的cDNA，序列测定证实与文献报道的序列一致；成功构建了6×His融合的表达载体pRSETA RD；表达了RD/6×His融合蛋白，并纯化得到了RD/6×His蛋白.结论：成功克隆了人akt1的调节结构域RD基因，构建了6×His融合的表达载体，表达了RD/6×His融合蛋白并得到了纯化的RD/6×His蛋白.
【关键词】 PKB /Akt ；克隆，分子； 基因表达 ；纯化
0引言
PKB/Akt分子由三部分组成，第一部分为N端的pH结构域，第二部分为中间的催化结构域，第三部分为C端的调节结构域（regulation domain， RD）［１－３］ .PKB/Akt参与某些生长因子或淋巴因子诱导的靶细胞应答，影响胞内糖类的转运、糖原的合成及蛋白质的合成，抑制细胞凋亡等，是机体维持正常生命活动的一个重要调节分子［４］.PKB/Akt催化结构域中的Thr308和调节结构域中的Ser473都发生磷酸化后，使其活性被激活，进而调节下游分子，执行相应功能［５］.调节结构域中的Ser473的磷酸化对PKB/akt发挥最大活性至关重要［６］.催化结构域的Thr308的磷酸化是由上游的PDK1催化的［７，８］，而使位于调节结构区的Ser473发生磷酸化的激酶（即人为设想的PDK2）至今未找到明确的分子［９］.因此，克隆并纯化得到PKB/Akt的调节结构域，将为寻找PDK2分子及研究PKB/Akt分子的调节结构域对整个分子的调节作用奠定实验基础.
1材料和方法
1．1材料 T4 DNA 连接酶购自TaKaRa Biotech公司；EcoR I ，NheI限制性内切酶购自晶美生物工程有限公司；AMV反转录酶购自Promega公司；pRSETA载体购自Invitrogen 公司；金属螯合亲合层析中所用Ni2+ NTA琼脂糖介质购自Qlagen公司；大肠杆菌BL21由本室冻存；异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）购自华美公司；Akt单抗购自Cell signal 公司；HRP标记的兔抗鼠二抗购自Santa Cruz Biotecknology；Western 发光底物为Perce 产品.
1．2方法
1.2.1引物设计搜索GenBank人 akt1的调节结构域的 cDNA序列利用Oligo分析软件，在其编码区的两侧设计一对引物，5′端引物序列为 5′CGGAATTCATGC ATCATCATCATCATCATGCTAGCATCGTGTGGCAGCACGTGTAC3′；3′端引物序列为 5′CGAAGCTT AAGCTATCGTCC AGCGCAGTC3′.5′引物中加入了EcoRI ，6×his和NheI 位点；3′引物加入了HindⅢ 位点.引物由北京赛百盛公司合成.
1．2.2组织总RNA的提取及定量 按每100 mg组织加入1 mL提取液的比例，加入预冷的TRIzol提取液在玻璃匀浆器中充分匀浆，其余步骤严格按TRIzol Reagent说明书进行.所得RNA经DNase I 消化后，溶解于DEPC处理水中.紫外分光光度法定量.
1．2.3RTPCR扩增RD的 cDNA 从人肝组织提取总RNA，逆转录反应按试剂盒中的说明书进行.取1 μg总RNA，在25 μL体系中以Oligo(dT)15为引物，应用AMV逆转录酶合成第一条链cDNA.具体反应体系为：总RNA 1 μg与Oligo(dT)15 2 μL，70℃，10 min ，然后加入5×RT Buffer 5 μL，dNTP(10 mmol) 2.5 μL ，RNase inhibiter 1 μL，AMV逆转录酶3 μL ，DEPC水 9.5 μL.42℃水浴1 h ，沸水浴5 min，-20℃保存.取1 μL逆转录产物为模板，在25 μL反应体系中先将模板于95℃变性5 min，加入16.67 nkat Taq DNA聚合酶，在PE2400 PCR 循环仪中反应.循环参数：94℃ 30 s， 60℃ 40 s ，72℃ 30 s ， 30 cycles ，于72℃延伸15 min.用12 g・L１琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物.
1．2.4DNA序列测定 PCR扩增产物用上海华舜公司胶回收试剂盒回收，将回收的目的片段克隆到测序载体pMD 18T中测序.
1．2.5表达载体RDpRSETA的构建用NheI/HindⅢ将RD从测序载体pMD 18T中切下，插入pRSETA表达载体，构建出重组表达载体pRSETA RD.
1．2.6融合蛋白的表达时间及表达形式分析将重组质粒转化BL21感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中（0.1 g・L-1 氨苄青霉素）培养过夜.取50 μL菌液转接5 mL含氨苄青霉素的LB中，待A600 nm= 0.6~0.8时加入IPTG至终浓度为1 mmol・L１诱导表达.每小时收一次菌（约1 mL）.取第5 小时的菌50 mL，超声裂菌（输出频率为60 Hz，4℃，5次，每次15 s），离心（12 500 g ，4℃，60 min），取上清用0.45 μm 滤膜过滤，加入NaN3至0.2 g・L-1，存于4℃备用.分别取适量上清和沉淀及不同时间的总菌体进行SDSPAGE，分析目的蛋白质的不同时间的表达情况和分布情况［１０，１１］.
1．2.7Wester blotting 检测 RD蛋白将表达RD蛋白的菌体裂菌进行SDSPAGE电泳，转移至硝酸纤维滤膜（NC膜）上， 50 g・L-1的脱脂奶粉封闭1 h，抗Akt mAb（11000鼠抗）4℃平摇过夜；室温PBST漂洗两次，兔抗鼠IgG 2 mL室温封闭1 h， PBST漂洗2次后，化学发光验证所表达的目的蛋白.
1．2.8金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白质裂菌上清以15 ~ 20 mL・h１的流速过Ni2+NTA柱，随后以Wash液洗柱(在裂解液中加入咪唑至20 mmol・L１)，再分别用含有咪唑浓度为100 mmol・L１和200 mmol・L１ Elution液洗柱，收集洗脱液，待SDSPAGE分析后合并含洗脱蛋白质的组分［１２］.
2结果
2． 1人akt1的RD cDNA的克隆及测序用RTPCR技术，从人脑组织RNA中扩增得到约256 bp的人akt1 cDNA 片段， 将目的片段克隆到测序载体pMD 18T中进行序列测定.测序结果表明，所克隆的人akt1的RD cDNA片段与GenBank（XM_005243）登录的序列完全一致.
图 1pRSETARD表达载体的构建示意图（略）
Fig 1 Construction of the recombinant expression vector pRSETARD（略）
2． 2RD/6×His融合表达载体的构建克隆的质粒pMD18T RD经NheI和HindⅢ双酶切下256 bp片段，将此片段连入原核表达载体pRSETA，连接转化大肠杆菌BL21，构建的重组质粒经NheI和HindⅢ双酶切产生256 bp片段（Fig 1， 2），6×His融合的表达载体pRSETA RD构建成功.
M : DL2000 Marker; 16 : Digested by NheI and HindⅢ.
图2pRSETA RD重组质粒的酶切鉴定（略）
Fig 2Identification of pRSETARD recombinant plasmid（略）
236×His融合的RD蛋白可溶性分析及不同时间诱导表达分析重组表达载体 pRSETARD经01 mmol IPTG诱导在 Mr 16 000 处出现一条新的蛋白条带，与预计的蛋白大小基本符合(Fig 3，4)，未经诱导的含目的片段的载体无此条带.经初步认定该新生条带为表达的RD/6×His融合蛋白，经Imagertm凝胶成像分析系统扫描定量［１０］，表达的融合蛋白约占总菌体的67%.
M: Protein marker; 1: Induced pRSETA; 2: Total protein after IPTGinduction;3: Fusion protein in the supernatant; 4: Fusion protein in the precipitation .
图36HisRD融合蛋白的表达及可溶性的SDSPAGE分析（略）
24Western blotting 检测 RD蛋白Western blotting结果显示PKB/Akt RD的蛋白（Ｆig 5).
2. 5RD/6×His融合蛋白纯化表达的融合蛋白质经Ni2+NTA偶联的琼脂糖珠“锚定”纯化， 在咪唑浓度为100 mmol ・L１的洗脱液中得到纯度为67%的目的蛋白.
M : Protein marker ; 1: uninduced PRSETARD ; 2: Induced PRSETARD about 1 hour;3: Induced PRSETARD about 2 hour; 4: Induced PRSETARD about 3 hour ; 5: Induced PRSETARD about 4 hour; 6: Induced PRSETARD about 5 hour ; 7: Induced PRSETARD about 6 hour.
图 4RD/6×His蛋白的诱导时间分析（略）
Fig 4Analysis of expression time of RD/6×His protein（略）
1:pRSETA; 2: pRSETARD uninduced ; 38: pRSETARD induced by IPTG.
图5通过蛋白印迹的方法确定表达的是PKB/Akt的调节结构域RD（略）
Fig 5Identification of the RD protein by Western blotting（略）
3讨论
Akt，又称蛋白激酶B（protein kinaseB，PKB），是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.目前发现至少存在3种Akt家族成员：Akt1/PKBα，Akt2/PKB β， Akt3/PKBγ.细胞Akt(cellular Akt ，cAKT)是逆转录病毒基因Akt8的细胞同源物，105 ku的逆转录病毒（retrovirus AKT，vAKT）是cAKT与病毒gag序列的融合蛋白.Akt/PKB催化区与PKA有65%同源性，与PKC有75%同源性，因此又被命名为A/C相关的激酶（related to A and C kinase ，RAC）.但不同的是，AKT氨基端含有一个能特异性作用于底物中丝氨酸/苏氨酸残基并使其磷酸化的血小板白细胞（激酶底物同源结构域Pleckstrin Homology pH）区，可介导脂质蛋白质或/和蛋白质蛋白质之间的相互作用，羧基端是疏水区，富含脯氨酸.Akt的pH区在进化中是高度保守的，表明其可能具有重要的功能.丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKB/Akt成为近几年来研究的热点分子，它在信号转导中起着关键作用.最近的研究显示PKB/Akt通过刺激细胞再生或/和抑制细胞的凋亡在肿瘤形成过程中扮演着重要的角色；同时在胰岛素的信号转导途径中是一个重要的参与分子.PKB/Akt分子的活化需要催化结构域中的Thr308和调节结构域中的Ser473都发生磷酸化，Thr308的磷酸化使PKB/Akt具有了活性，而Ser473的磷酸化则使得PKB/Akt的活性达到最大［５］.Thr308磷酸化的蛋白激酶PDK1已经明确［７，８］，而使Ser473磷酸化的蛋白激酶PDK2至今未找到明确的分子.另外，PKB/Akt的调节结构域对整个分子活性的影响仍在研究.
我们从人胚胎的肝组织中提取总RNA进行RTPCR获得了人akt1的RD的基因，测序分析证实，与人的akt的调节结构域的基因序列完全一致［8］. 为使融合基因得到高效及稳定的表达和考虑到将来的纯化工作，我们构建了6×His融合表达载体pRSETA RD，在大肠杆菌BL21中获得了高效表达.但是表达的蛋白比预测的要大8 ku，做Wester blotting显示其确为RD蛋白，在分析了RD蛋白的氨基酸序列后发现，其C末端有一个半胱氨酸，推测可能是形成了二聚体结构，从而导致了分子质量变大，符合电泳的结果，或者是因为目前我们不知道的其他原因导致了分子大小的改变.最后将融合蛋白通过Ni2+NTA金属螯合亲和层析柱纯化得到了RD蛋白，为寻找和确定PDK2分子，研究PKB/Akt的调节结构域以及对整个分子的调节作用奠定了实验基础.
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