作者：李树钧，戚好文，叶江枫，帝新宇，季少平，何鹏，张英起，药立波
【关键词】 嗜酸粒细胞
【Abstract】AIM: To investigate the activity of MIP4 mutant (MetMIP4) in blocking eosinophils chemotaxis in vitro by expressing MetMIP4 in E. coli and purifying it. METHODS: The gene of MetMIP4 was inserted into the expression vector pRSETA and pRSETMetMIP4 fusion protein was expressed by IPTG induction. After E. coli. was lysed by ultrasonic wave， the solubility of the fusion protein was determined by SDSPAGE gel electrophoresis. Protein in supernatant was purified by Ni2+NTA agarose beads. The activity of pRSETMetMIP4 protein in inhibiting eosinophils chemotaxis was determined with 24well chemotaxis plate filter. RESULTS: The pRSETMetMIP4 fusion protein was expressed in E. coli. The solubility of the fusion protein reached 80% and the purity of the fusion protein was 87% by Ni2+NTA agarose beads. Eosinophil was purified from asthmatic blood and Eosinophil purity was 90%. Investigation of biological function of the fusion protein showed that the fusion protein inhibited the eosinophils chemotaxis. CONCLUSION: The pRSETMetMIP4 protein has been correctly expressed in E. coli and the fusion protein is soluble. Study of the biological function of the fusion protein indicates that the fusion protein can inhibit eosinophils chemotaxis in vitro.
【Keywords】 chemotactic factors; eosinophils; gene expression; genetic vectors
【摘要】 目的： 为研究MIP4（巨噬细胞炎性蛋白4）的突变体在拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用中的活性，构建MIP4突变体（MetMIP4）并进行原核表达和纯化，体外观察其拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用. 方法： 将MetMIP4基因片段插入到pRSETA融合表达载体中.诱导表达后，表达工程菌经超声裂菌后鉴定可溶性，细菌裂解上清经镍螯合亲和层析纯化.采用葡聚糖沉淀法分离和纯化嗜酸粒细胞，利用24孔Transwell双层板鉴定融合表达蛋白的趋化和抗趋化活性.结果： 构建入融合表达载体pRSET A的基因在大肠杆菌中得到表达.裂菌后鉴定显示融合蛋白可溶部分占80%，经镍螯合亲和层析纯化后纯度达87%.分离的嗜酸粒细胞纯度达到90%.拮抗嗜酸粒细胞趋化活性实验表明，纯化的MetMIP4蛋白具有明显拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用.结论： MetMIP4突变体基因在pRSET A融合表达载体中获得可溶性表达和纯化，生物学活性实验表明融合的pRSETMetMIP4蛋白具有拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用的活性， 为进一步开发其临床应用奠定了基础.
【关键词】 趋化因子；嗜酸粒细胞；基因表达；遗传载体
0引言
嗜酸粒细胞在外周血和周围组织中的聚集是过敏性疾病、寄生虫感染和许多系统性疾病的标志性特征.正常情况下，嗜酸粒细胞中只有一小部分存在于血液循环或组织中，在疾病状态下可发生特征性的升高，这表明人体存在选择性调节嗜酸粒细胞生成和聚集的分子机制.过敏反应时被激活的嗜酸粒细胞、Th3细胞滤过到组织，β趋化因子受体(CC chemokine receptor 3， CCR3)在这个过程中起到主要作用.CCR3特异地表达于嗜酸粒细胞、Th3细胞表面［１，２］，已经在几种动物模型中证明可以通过同源重组减少Eotaxin.用这种配体的抗体或注射受体拮抗剂MetRANTES减少过敏性炎症［３，４］.文献［５］证实MetMIP4是一种强力和特异的CCR3拮抗剂，在1 nmol・L-1浓度时就能完全阻滞最强力的CCR3激动剂Eotaxin和MCP4引起的嗜酸粒细胞趋化.我们通过合成经过改造的CCR3拮抗剂pRSETMetMIP4，进行表达和纯化，并观察对嗜酸粒细胞趋化功能的影响.
1材料和方法
1．1材料克隆载体pUC19、表达载体pRSET A和E coli JM109(DE3)由本校生物化学与分子生物学教研室提供；DNA重组所用各种限制性内切酶、T4 DNA 连接酶 、反转录酶、PCR反应系统（Taq DNA聚合酶、dNTP，10×PCR缓冲液及MgCl2）购自华美生物工程公司；葡聚糖购自Sigma公司；Transwell 趋化板购自Costar公司.
1．2方法
1．2．1原核表达载体pRSET MetMIP4的构建pRSET A空载体以及测序证实连有MetMIP4的重组pUC19质粒经EcoRI和 BamHI双酶切，回收切下的目的片段与切开的pRSET A载体，用T4 DNA 连接酶连接后，转化入大肠杆菌JM109(DE3)中，挑取克隆，用上海华舜试剂盒提取质粒，经EcoRI 和BamIH 双酶切鉴定获得阳性克隆.
1．2．2pRSET MetMIP4融合蛋白的表达 重组的pRSET MetMIP4阳性克隆重新转化大肠杆菌JM109(DE3)中，于含氨苄青霉素（100 mg・L-1）的培养基中，37℃培养过夜，转接后培养至A600 nm=0.5左右，加入IPTG（异丙基D硫代半乳糖苷）至终浓度为0.2 mmol・L-1， 24 ℃诱导（为增加可溶性）培养2 h.常规方法收菌，进行SDSPAGE凝胶电泳观察融合蛋白的表达［６］.
1．2．3pRSET MetMIP4融合表达蛋白的可溶性分析获得融合蛋白表达的菌株经大量诱导后收菌，加入细菌裂解液（50 mmol・L－１Nah3PO4， pH 8.0， 300 mmol・L-1 NaCl，1 mmol PMSF），超声裂菌（输出功率为40 Hz， 4℃ ， 2×1 min）. 12 000 g，4 ℃离心30 min ，收集上清和沉淀，分别加入2×上样缓冲液（100 mmol・L-1 TrisCl， 200 mmol・L-1 DTT， 40 g・L-1 SDS， 2 g・L-1溴酚蓝， 200 mL・L-1甘油）， 煮沸5 min，离心5 min，进行SDSPAGE凝胶电泳，观察融合蛋白的可溶性.
12. 4融合表达蛋白pRSET MetMIP4的纯化 获得表达的融合蛋白的菌株经大量诱导后收菌， PBS洗2遍，加入MCAC0（20 mmol・L-1 TrisCl，05 mol・L-1 NaCl， 100 mL・L-1甘油，1 mmol PMSF， pH 7.9），超声裂菌（输出功率为40 Hz， 4 ℃， 2×1 min）.12 000 g，4 ℃离心30 min，收集上清，加入TritonX100至终浓度为1 mL・L-1， 经0.45 μm滤膜过滤.滤过后的上清以10~15 mL・h-1的流速过Ni2+-NTA柱.随后分别以MCAC0，MCAC30（MCAC0中加入咪唑至30 mmol・L-1），MCAC100（MCAC0中加入咪唑至100 mmol・L-1，余类推），MCAC200，MCAC300和MCAC500洗柱，收集洗脱液，SDSPAGE分析后，合并含有目的蛋白的组分.以分子截流量为10 000的透析膜于透析缓冲液（20 mmol・L-1 TrisCl，0.5 mol・L-1 NaCl， pH 7.4）中透析24 h后，冻干浓缩.采用Bradford法蛋白定量.
1.2.5血嗜酸粒细胞的分离和纯化取哮喘自愿者静脉血20 mL，用27 g・L-1 EDTA抗凝，加入50 g・L-1葡聚糖TBS缓冲液，静置45 min，吸取富含白细胞的上层液，加在淋巴细胞分离液，1000 g离心20 min， 弃取单个核细胞，管底颗粒细胞用比重为1.070 kg・L-1的percoll液(含100 mL・L-1FCS)调细胞数为1.5×109・L-1， 将percoll原液用10×PBS溶解，用1×PBS调成所需浓度，在10 mL离心管中，依次加入比重为1.070，1.080，1.090 ，1.100 kg・L-1 的percoll液1，1，2，1 mL，最后加入1 mL颗粒细胞悬液.1000 g离心15 min， 回收比重为1.100和1.090 percoll液交界面的细胞层，重悬于Hank’s液中，取少许涂片，Wright染色，测定嗜酸粒细胞纯度［７］.
1．2．6嗜酸粒细胞的趋化活性测定纯化的嗜酸粒细胞用Hank’s液重悬，调细胞数为1×1012・L-1， 加入40 μL的分离纯化的嗜酸粒细胞悬液到24孔Transwell细胞趋化板的上层孔中.实验分为2组1组下层孔加趋化剂Eotaxin至终浓度为50 nmol・L-1， 2组下层孔中加入终浓度为50 nmol・L-1的趋化剂Eotaxin和50 nmol・L-1的MetMIP4蛋白，每组6孔，37 ℃培养5 h，通过上、下层的细胞数，计算嗜酸粒细胞的趋化百分比， 确定pRSET MetMIP4蛋白拮抗嗜酸粒细胞的趋化活性.通过细胞分类计数，分离的嗜酸粒细胞纯度约90%.苔盼蓝染色检查活力，嗜酸粒细胞活力大于90%.
2结果
2．1MIP4突变体的克隆 PCR扩增的MIP4突变体，连入克隆载体pUC19中，经测序证实，与所要克隆的序列一致.
2．2pRSET MetMIP4融合蛋白的表达用EcoRI和 BamHI双酶切连有插段的克隆载体pUC19，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段，与相同酶切表达载体pRSETA连接，转化入大肠杆菌JM109（DE3）中.经相同酶切鉴定，获得正确的重组pRSETMetMIP4表达载体.转化入大肠杆菌JM109(DE3)中，经IPTG于24 ℃条件下诱导2 h.常规方法收菌行SDSPAGE，电泳结果显示诱导后Mr 约为１２×103的新生蛋白条带出现（Fig 1），与预期的蛋白分子质量相近.
1，2：Expression of fusion protein MetMIP4 induced by IPTG； 3：Expression of fusion protein MetMIP4 without IPTG induction； 4：pRSETA vector in E.coli induced by IPTG； 5：Protein marker.
图1MIP4突变体原核表达载体pRSET A的融合表达，大小约12 Ku（略）
Fig 1Expression of fusion protein MetMIP4 in SDSPAGE（略）
2. 3融合蛋白pRSETMetMIP4的可溶性分析转入大肠杆菌JM109(DE3)中的pRSET MetMIP4融合表达载体经IPTG，24℃ 诱导表达，获得表达的菌体经超声裂菌，分别取上清和沉淀作SDSPAGE（聚丙烯酰胺凝胶），结果显示融合蛋白存在与上清和沉淀中，由于上清体积大于沉淀，经计算可溶性约占80% (Fig 2).
1：Protein marker； 2：Supernatant of E.coli lysate expressing fusion protein MetMIP4； 3：Precipitation of E.coli lysate expressing fusion protein MetMIP4； 4：Full E.coli expressing fusion protein MetMIP4.
图2MIP4突变体原核表达载体pRSET A的融合表达的可溶性 （略）
2. 4MIP4突变体原核表达融合蛋白的纯化 转入大肠杆菌JM109(DE3)中的pRSET MetMIP4融合表达载体经IPTG，24 ℃诱导表达和裂菌后，上清经镍螯合亲和层析柱纯化，收集洗脱液，经SDSPAGE蛋白电泳，得到了纯化的融合表达蛋白，纯度达87%（Fig 3）.
1：Protein marker， 97， 66， 43， 30， 21 and 14 Ku，respectively， from top to bottom； 2：Eluted fraction of fusion protein MetMIP4 with MCAC100； 3：Eluted fraction of fusion protein MetMIP4 with MCAC200； 4：Eluted fraction of fusion protein MetMIP4 with MCAC300；5：Eluted fraction of fusion protein MetMIP4 with MCAC500； 6：Fraction flowed through Ni2+NTA agarose.
图3MIP4突变体原核表达融合蛋白的纯化（略）
Fig 3Purification of fusion protein MetMIP4 with MCAC in SDSPAGE（略）
2. 5MIP4突变体融合表达产物拮抗嗜酸细胞的趋化第1组和第2组嗜酸性粒细胞的趋化百分比分别为70%，29%.结果表明融合蛋白MetMIP4可明显抑制趋化剂Eotaxin诱导的嗜酸粒细胞的趋化作用， 两组相比差异显著（P&<0.01）.
3讨论
趋化性细胞因子是一族对各种白细胞亚类如中性粒细胞、淋巴细胞具有显著趋化作用的细胞因子，可分为CXC和CC两个主要亚家族， CXC趋化性细胞因子主要趋化中性粒细胞和T细胞.CC 趋化性细胞因子趋化除中性粒细胞外的其他白细胞，又称β趋化因子，其配体为Eotaxin， MCP3， MCP4和RANTES，主要趋化嗜酸粒细胞、单核细胞.趋化性细胞因子受体有7个跨膜片段，受体的胞内侧是与G蛋白偶联的，G蛋白与多种信号有着广泛的联系，G蛋白的α和β亚单位作为信号效应器而激活细胞内的生物学效应.根据配体亚家族，其受体被分为CCR， CXCR， CX3CR和XCR［８］.
目前认为哮喘主要是以嗜酸粒细胞浸润为主的气道慢性炎症［９］.在哮喘气道炎症调控机制中，不同的趋化因子激活不同的细胞与分子途径，以协调方式构成复杂的细胞因子网络.嗜酸粒细胞可以释放血小板激活因子、白三烯、白细胞介素、嗜酸性阳离子蛋白和趋化因子等，直接参与哮喘的发病.在众多的趋化因子中，迄今只有Eotaxin被证明具有特异性激活嗜酸粒细胞作用，对中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等均无活性.因此对Eotaxin 的研究，不仅有助于从嗜酸粒细胞趋化的角度探讨哮喘特异性气道炎症的本质，亦可能在特异地阻断嗜酸粒细胞募集的环节上，探讨新的不干预正常的细胞/因子活性的平喘药物［１０］.在IL2和IL4存在的情况下，Eotaxin 通过T 细胞的CCR3激活T 细胞趋化和粘附活性［１１］.Eotaxin 还可以通过ERK2和p38导致嗜酸粒细胞趋化和脱颗粒［１２］，说明Eotaxin能够明显地影响嗜酸粒细胞的功能.而突变的MetMIP4能拮抗CCR3受体的活性，阻断其介导的信号途径［１３］，抑制过敏性炎性反应.我们通过MIP4氨基末端的丙氨酸改造为蛋氨酸，成功地突变了MetMIP4，通过序列测定，完全符合序列设计，并且成功地进行了融合表达和纯化.MIP4也是PARC，DCCK1，AMAC1［１４］.实验显示融合6个组氨酸残基对MetMIP4活性无明显影响，能够通过CCR3阻滞嗜酸粒细胞的趋化.由于pRSETMetMIP4能特异地作用于嗜酸粒细胞、Th3细胞，而且不干扰中性粒细胞功能，因而有望成为抗哮喘和其他过敏性疾病的药物.
【参考文献】
［1］Bonecchi R， Bianchi G， Bordignon PP， D′Ambrosio D， Lang R， Borsatti A， Sozzani S， Allavena P， Gray PA， Mantovani A， Sinigaglia F. Differential expression of chemokine receptors and chemotactic responsiveness of type 1 T helper cells (Th1s)and Th3s［J］. J Exp Med，1998;187(1):129-134.
［2］Ponath PD， Qin S ， Post TW， Wang J， wu L， Gerard NP， Newman W， Gerard C， Mackay CR. Molecular cloning and characterization of a human eotaxin receptor expressed selectively on eosinophils［J］. J Exp Med， 1996;183(6):2437-2448.
［3］Rothenberg ME， Maclean JA， Pearlman E， Luster AD， Leder P. Targeted disruption of the chemokine eotaxin partially reduces Aginduced tissue eosinophilia［J］. J Exp Med， 1997; 185(4): 785-790.
［4］Elsner J， Petering H， Hochstetter R， Kimming D， Wells TN， Kapp A， Proudfoot AE. The CC chemokine antagonist MetRANTES inhibits eosinophil effector funtions through the chemokine receptors CCR1 and CCR3［J］. Eur J Immunol，1997;27(11):2892-2898.
［5］Nibbs RJ， Salcedo TW， Campbell JD， Yao XT， Li Y， Nardelli B， Olsen HS， Morris TS， Proudfoot AE， Patel VP， Graham GJ. CC chemkine receptor 3 antagonism by the βchemkine macrophage inflammatory protein 4，a property strongly enhanced by an AminoTerminal AlanineMethionine Swap［J］. J Immunol， 2000;164(3):1488-1497.
［6］Yuan JL， Wang Z， Wu GJ， Hao XK. Construction and expression of antiprostate specific antigen Vh single domain antibody gene［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ )， 2001;22(5): 425-428.
［7］Wu CJ，Mao BL， Sun B. Effects of vasoactive intestinal peptide on degranulation and adhesion of eosinophils［J］. Chin J Appl Phsiol， 2000;16:239-242.
［8］Premack BA， Schall TJ. Chemokine receptors: Gateways to inflammation and infection［J］. Nat Med， 1996; 2(11):1174-1178.
［9］Li SJ， Sun B. The effect of ginkgolide B on airway reactivity and eosinophil in asthmatic guinea pig［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ) ， 1995;16(4):269-271.
［10］Saeki T， Ohwaki K， Naya A， Kobayashi K， Ishikawa M， Ohtake N， Noguchi K. Identification of a potent and nonpeptidyl ccr3 antagonist［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2001;281(3): 779-782.
［11］Jinquan T， Quan S， Jacobi HH， Reimert CM， Millner A， Hansen JB， Thygesen C， Ryder LP， Madsen HO， Malling HJ， Poulsen LK. Cutting edge: Expression of the NF of activated T cells in eosinophils: Regulation by IL4 and IL5［J］. J Immunol， 1999; 163(1): 21-24.
［12］Shyamala V， Khoja H. Interleukin8 receptors R1 and R2 activate mitogenactivated protein kinases and induce cfos，independent of Ras and Raf1 in Chinese hamster ovary cells［J］. Biochem， 1998:37(45):15918-15924.
［13］Kampen GT， Stafford S， Adachi T， Jinquan T， Quan S， Grant JA， Skov PS， Poulsen LK， Alam R. Eotaxin induces degranulation and chemotaxin of eosinophils through the activation of ERK2 and P38 mitogenactivated protein kinases［J］. Blood， 2000;95(6): 1911-1917.
［14］Adema GJ， Hartgers F， Verstraten R， de Vries E， Marland G， Menon S， Foster J， Xu Y， Nooyen P， McClanahan T， Bacon KB， Figdor CG. A dendriticcellderived cc chemokine that preferentially attracts naive T cells［J］. Nature， 1997;387(6634):713-717.