作者：尹时华，龚树生，鄢开胜，李穗，陈沛，陈广理
【关键词】 水杨酸钠
【Abstract】 AIM: To study the effects of sodium salicylate on the expression of NGB mRNA and protein in inferior colliculus neurons in mice. METHODS: Fortyeight Kunming mice were pided into four groups: control group (A) ［200 mg/(kg・d)］， ［300 mg/(kg・d)］， and ［450 mg/(kg・d)］ sodium salicylate administrated groups (B， C， D). The expression of NGB mRNA was measured by using RTPCR and the protein expression of NGB was measured by WesternBlot. RESULTS: The expression of NGB mRNA in control group increased remarkably than that in the other three sodium salicylate administrated groups (group B， C， D)（P&<0.01）. The expression of NGB mRNA was the lowest in group D and the highest in group B among group B， C and D， with significant difference between group C and D (P&<0.05). NGB protein with relative molecular mass 17 000 was observed in all groups by WesternBlot. The protein expression in group A was significantly higher than that in the other 3 sodium salicylate administrated groups. The protein expression of B group was the highest in group B and the lowest in group D in the three sodium salicylate administrated groups. CONCLUSION: Administration of sodium salicylate can decrease the expression of NGB mRNA and protein in inferior collicuLus neurons of mice and these changes are related to the dosage of sodium salicylate.
【Keywords】 sodium salicylate；mice；nucleus of inferior colliculus； neuroglobin
【摘要】 目的： 观察水杨酸钠给药对小鼠下丘核NGB mRNA和蛋白表达的影响. 方法： 成年健康昆明小鼠48只分为A，B，C，D四组，每组12只. A为对照组，B，C，D分别为水杨酸钠200， 300和450 mg/(kg・d)给药组. 给药15 d后处死检测；采用RTPCR检测实验小鼠下丘核区NGB mRNA的表达；WesternBlot分析NGB蛋白表达. 结果： ①对照组小鼠下丘核区NGB mRNA表达明显高于三个水杨酸钠给药组（P&<0.01）；三个水杨酸钠给药组NGB mRNA表达比较以D组表达最低，B组表达最高，C组与D组比较有显著性差异（P&<0.05）. ②WesternBlot检测结果显示实验各组均表达相对分子质量约为17 000的NGB蛋白. A组NGB蛋白表达明显高于其他各组；三个水杨酸钠给药组以B组表达最高D组表达最低. 结论：水杨酸钠可显著降低下丘核神经元NGB mRNA和蛋白表达；水杨酸钠给药对下丘核神经元NGB mRNA和蛋白表达与给药剂量有关.
【关键词】 水杨酸钠；小鼠；下丘核；脑红素
0引言
自从Burmester等［1］首次报道人和小鼠脑内存在特异的功能上类似于肌红蛋白的携氧球蛋白脑红蛋白(neuroglobin，NGB)以来，围绕NGB的研究已在国际范围内掀起重新认识和研究脑缺氧的热潮. 下丘核是最重要的听中枢皮下会聚站［2］，在声信号处理过程中起着至关重要的作用，它在声音频率、强度、时间因素及声源定位的分析中均起着重要的作用. 水杨酸类药物抗炎作用的机制之一是通过阻断前列腺素环氧化酶的活性以抑制花生四烯酸的代谢产物前列腺素类的合成［3，4］. 众所周知，花生四烯酸是前列腺素类(PGs)和白三烯类(LTs)的前体，而后者是作用于血管的介质，可影响血管的舒缩功能. 可以推测，水杨酸钠可能通过阻断前列腺素环氧化酶的活性减少血管内皮扩血管介质PGI2和PGE2的生成，相应刺激缩血管介质LTs的合成，从而引起血流量的减少，并可导致组织缺血缺氧的发生. 水杨酸钠是否影响下丘核脑组织血流量，是否可导致组织缺血缺氧的发生以及是否影响携氧球蛋白NGB的含量、表达等，对明确水杨酸钠给药引起耳鸣、听力下降［5］等毒副作用的进一步认识有着十分重要的意义. 我们以小鼠为实验对象研究水杨酸钠给药对小鼠下丘核NGB mRNA和蛋白表达的影响，以进一步探讨水杨酸钠给药后引起耳鸣、听力下降的中枢机制，并为耳鸣、听力下降的临床用药提供理论指导.
1材料和方法
1.1材料
TRIzol试剂、cDNA合成试剂盒（MBI公司）;Taq DNA聚合酶(生工公司); DL2000Marker(大连宝生物); 48只成年健康昆明小鼠18～25 g， 雌雄不拘(华中科技大学同济医学院动物中心提供）.
1.2方法
1.2.1分组与处理小鼠48只随机分成A， B， C， D四组，每组12只. A：对照组；B， C， D分别为200， 300和450 mg/(kg・d)水杨酸钠给药组， 各组均经腹腔注射给药，A组给以同体积的生理盐水，所有动物自由饮食. 给药15 d后处死检测.
1.2.2RTPCR检测实验小鼠下丘核区NGB mRNA的表达
1.2.2.1实验小鼠下丘核区总RNA的提取取昆明小鼠下丘核区脑组织100 mg移入1.5 mL EP管中；加Trizol试剂1 mL，混匀，置室温5 min；加氯仿0.2 mL，摇震15 s， 置室温2～3 min；4℃，10 000 g离心5 min；仔细吸取上层水相，移至另一EP管中；加0.5 mL异丙醇， 置室温10 min；4℃，10 000 g离心10 min；750 mL/L乙醇(DEPC水配制) 1 mL，摇震，充分洗涤沉淀，4℃ 10 000 g离心5 min；弃上清，中空干燥后沉淀重悬于无Rnase水中-70℃保存备用. 以电泳和波长260 nm光谱吸收的情况来判定所抽提RNA的质量和浓度.
1.2.2.2cDNA第一链的合成方法将总RNA 0.1～5 μg， oligol(dT)8引物（5 μg/mL） 1 μL加无Rnase水至12 μL轻轻混匀，依次加入EP管，离心3～5 s. 将混合物置70℃ 5 min. 置冰上冷却并离心（短暂）. 将EP管置于冰上，依次加入试剂5×Buffer 4 μL， Rnase抑制剂（20 U/μL） 1 μL， 10 mmol/L dNTP 2 μL. 37℃孵育5 min；加入逆转录酶（200 U/μL） 1 μL 42℃孵育60 min；70℃加热10 min，冰上冷却，-70℃保存备用.
1.2.2.3扩增引物合成和PCR反应条件及体系扩增引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下：NGB (615 bp Genbank accession number BC024263)上游：5′CTAGTCGACGAGATGGCGCTGCAT3′下游5′CGCGGATCCACTACAACAGGCAGATCAAC3′，扩增片段615 bp. βactin上游：5′GACGATGATATTGCCGCACT3′ 下游: 5′GATACCACGCTTGCTCTGAG3′扩增片段186 bp (Genbank accession number AB117093).
PCR反应体系包括：ddh3O 35 μL，MgSO4 buffer 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，P1 1 μL， P2 1 μL，Template 2 μL， Taq酶1 μL. 将其混匀，短暂离心30 s. 94℃预变性4 min，94℃ 30 s，55℃ 1 min 45 s，72℃ 2 min，循环30次，72℃延伸5 min. 取2 μL PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.
1.2.3WesternBlot分析实验小鼠下丘核区NGB蛋白的表达收集实验小鼠下丘核区脑组织. 用单去污法裂解细胞. 样品进行SDSPAGE后，电转移至硝酸纤维素膜， 加入含50 g/L去脂奶粉封闭液，室温摇床温育2 h. 封闭液按1∶400稀释兔多克隆抗小鼠NGB抗体，将结合蛋白的硝酸纤维素膜放入塑料袋，封口后置4℃过夜. 加入用50 g/L去脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗1∶5000（山羊抗IgG），置室温摇床1 h. TBS洗硝酸纤维素膜3次，每次20 min，室温摇动. 滴加化学发光试剂，X光片感光（感光胶片为Kodak产品）.
统计学处理: 所有数据以x±s表示，采用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析，P&<0.05认为有统计学差异.
2结果
2.1RTPCR检测实验小鼠下丘核区NGB mRNA的表达结果NGB mRNA表达的检测结果见Fig 1和Tab 1. 从Tab 1可见小鼠下丘核区NGB mRNA表达对照组明显高于三个水杨酸钠给药组（P&<0.01）；三个水杨酸钠给药组NGB mRNA表达比较以D组最低，B组表达最高，且明显高于C组（P&<0.05）和D组（P&<0.01），C组与D组比较有显著性差异（P&<0.05）.表1水杨酸钠给药对小鼠下丘核NGB mRNA和蛋白表达的影响（略）
3讨论
研究证明［6-8］慢性水杨酸钠给药对中枢神经系统有明显的损伤作用，导致神经元加速退行性变，认为引起中枢神经系统损伤的原因可能与水杨酸钠给药后可能导致中枢神经系统某些脑区局部缺血有关.
NGB在脑缺氧的适应性保护过程中起重要作用［9］，同时NGB可增加神经细胞的氧供应，提高神经细胞的存活和功能. 另外， NGB的含量降低可导致神经元对氧的利用率低，对缺氧的耐受性差，有可能是神经细胞易于变性死亡的一个因素.
本研究发现水杨酸钠给药后可明显下调下丘核脑组织NGB mRNA和蛋白的表达，并且这种影响与水杨酸钠给药剂量相关，即随给药剂量的增加下丘核脑组织NGB mRNA和蛋白的表达出现递减. 由于NGB在脑缺氧的适应性保护过程中起重要作用，故此推测水杨酸钠致中枢神经损伤可能与NGB表达的减少有关，因为NGB含量的降低必定会导致局部氧含量的下降，继而导致小鼠下丘核出现核不规则、核周间隙变宽、核周细胞质减少、核周细胞器呈片状液化消失、核糖体粗面内质网部分融合消失、线粒体的肿胀变性和髓鞘内结构变性溶解等下丘核超微结构的破坏也就不足为奇. 而线粒体等超微结构的破坏将影响细胞氧化供能和细胞的代谢功能，使脑功能降低. 髓鞘内结构变性将导致神经元之间联系的复杂程度降低，影响神经元之间信息的传导和处理功能. 是否NGB含量的减少与水杨酸钠给药后引起耳鸣和听力下降相关则有待电生理学和实验动物行为学的进一步证实.
【参考文献】
［1］ Burmester T， Weich B， Reinhardt SA. Vertebrate globin expressed in the brain［J］. Nature，2000;407(6803):520-523.
［2］ Jen PH， Sun X， Chen QC. An electrophysiological study of neural pathways for corticofugally inhibited neurons in the central nucleus of the inferior colliculus of the big brown bat， Eptesicus fuscus ［J］. Exp Brain Res， 2001; 137:292-302.
［3］ CandelarioJalil E， GonzalezFalcon A， GarciaCabrera M， et al. Assessment of the relative contribution of COX1 and COX2 isoforms to ischemiainduced oxidative damage and neurodegeneration following transient global cerebral ischemia［J］. J Neurochem， 2003;86(3):545-555.
［4］ Weissmann G， Montesinos MC， Pillinger M， et al. Nonprostaglandin effects of aspirin III and salicylate: Inhibition of integrindependent human neutrophil aggregation and inflammation in COX 2 and NF kappa B (P105)knockout mice［J］. Adv Exp Med Biol， 2002;507:571-577.
［5］ Ruttiger L， Ciuffani J， Zenner HP， et al. A behavioral paradigm to judge acute sodium salicylateinduced sound experience in rats: A new approach for an animal model on tinnitus［J］. Hear Res， 2003;180(12):39-50.
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［7］ Najbauer J， Schuman EM， Mamelak AN. The aspirin metabolite sodium salicylate causes focal cerebral hemorrhage and cell death in rats with kainic acidinduced seizures［J］. Neuroscience， 2000;99(1):107-117.
［8］ Venturini L， Sparber SB. Salicylate and cocaine: interactive toxicity during chicken midembryogenesis［J］. Free Radic Biol Med， 2001;30(2):198-207.
［9］ Reuss S， SaalerReinhardt S， Weich B， et al. Expression analysis of neuroglobin mRNA in rodent tissues［J］. Neuroscience， 2002;115(3):645-656.