作者：张永和 赵宁 易声禹 章翔
【关键词】 细胞损伤模型
关键词: 细胞损伤模型;空气压力;碘化丙啶;乳酸脱氢酶
摘 要:目的 建立一种空气高压力方法导致体外培养神经细胞的损伤模型，用于中枢神经系统各个细胞群及单个细胞在损伤中反应的研究. 方法 在空气高压的状态下致神经细胞损伤，并利用碘化丙啶（PI）荧光探针不能穿过正常的细胞膜、当细胞膜损伤后其通过细胞膜并与细胞核的DNA结合、在荧光显微镜下显红色及乳酸脱氢酶（LDH）的测定来检测细胞损伤. 结果 当空气压力增加到1.0MPa时，细胞损伤较对照组明显增加，压力增加到1.5MPa时，得到较为理想的损伤模型. 结论 本神经细胞损伤模型适合神经细胞损伤的病理、生理及生物化学的进一步研究.
Keywords:cell injuring model;air pressure;propidium io-dide;lactate dehydrogenase
Abstract:AIM To establish a method of cultured neuron in-jury models by high air pressure for the study of injured cell group or single cell in the central nervous system（CNS）.METHODS Neuron injuring model was produced by using high air pressure and assessed by nuclear uptake of the fluo-rescent dye propidium iodide（PI），which is excluded from cell with intact membranes however the dye penetrates in-jured cells and binds to DNA in the nuclei which then fluo-resces red.Lactate dehydrogenase（LDH）enzyme was mea-sured spectrophotometrically.RESULTS High air pressure of1.0MPa caused neuron injury and got the ideal injuring model by the air pressure of1.5MPa.CONCLUSION This model is appropriate for studying the biochemistry and patho-physiology of neuron injury.
0 引言
大体脑损伤模型及脑损伤的研究已取得了一些进展，这些研究是作为脑器官整体状态下的研究结果，对于其损伤后整个功能变化的结果和治疗效果有很大意义［1，2］ .但是，上述的研究方法对于中枢神经系统各类细胞在损伤中的反应还不能得到令人满意的结果，因而，体外培养细胞或组织片损伤模型［3-6］ 的建立为这类研究提供了方便.本实验设计采用气体迅速加压的方法，使培养的神经元和神经胶质细胞损伤，以用于中枢神经系统各个细胞群及单个细胞在损伤中反应的研究.
1 材料和方法
1.1 神经细胞培养 新生1d大鼠在无菌条件下切取鼠脑全脑，放入平衡盐液，切成约0.5mm3 碎块.将脑碎块移入12mL试管，用平衡盐液洗涤3次，依次洗涤后使组织块充分沉降到试管底部，弃上清.加入0.25g L-1 胰蛋白酶（溶于平衡盐液）10mL，37℃培养箱培养15min.将上述混悬液通过硅化的Pasteur滴管，充分捣碎组织，至得到单细胞悬液止;必要时用尼龙筛过滤.静置3～5min，使小组织块沉降至试管底并用Pasteur滴管将其除去.200r min-1 离心5min，弃上清.用培养液重新悬浮细胞，接种于培养皿，每皿接种（2.5～3.0）×106 个细胞.培养2d后用含10μmol L-1 胞嘧啶阿拉伯糖的培养液培养24h，然后改为常规培养液.鉴定方法:用破伤风抗毒素作为标记物，免疫组织方法检测，判定神经元细胞［7］ .
1.2 细胞损伤 培养好的神经细胞贴壁，分别放置于动物加压舱中，实验用空气为人工配制压缩空气（40mol L-1 氮氧混合气体），实验分为A，B，C及对照组，在室温下（26℃），分别给予空气压力0.5，1.0和1.5MPa，停留5min，对照组置于自然环境中，实验后用胰酶消化细胞收集至离心管中离心待检测.
1.3 检测方法 ①细胞膜完整性检测:碘化丙啶（propidium iodide，PI）不能穿过正常的细胞膜，当细胞膜损伤后，其通过细胞膜并与细胞核的DNA结合，在荧光显微镜下显色，这种方法曾被用以检测细胞损伤［8，9］ .按每毫升细胞培养液中加入浓度1g L-1 的PI10μL，置室温下10min，荧光显微镜下检测并计损伤细胞数;②乳酸脱氢酶（LDH）的测定:细胞损伤后释放乳酸脱氢酶（LDH），用0.25g L-1 胰蛋白酶消化实验模型的细胞，放入离心管中离心，取上清液，按岛津自动生化分析仪CL-700型的操作规程说明检测LDH活力.每组实验用二硝基甲苯（Triton X-1001mL20mL L-1 ）使细胞溶解，测定全部的LDH值，以计算损伤细胞的LDH百分比，分别于损伤后10，30min，2，6和24h测定.
统计学处理:数据以x ±s表示，对数据用SPLM统计软件进行t检验和方差分析.
2 结果
2.1 细胞膜损伤 PI染色，肉眼荧光显微镜下计数5个视野，荧光显色的细胞总数平均为:A组21，B组32，C组72及对照组12（Fig1～4）.计数结果显示空气压力至0.5～1.5MPa时，均造成不同程度的细胞膜损伤，且压力为1.5MPa时，损伤程度更重.
图1 －图4 略
2.2 LDH测定 空气压力在0.5MPa时，LDH释放百分比较对照组无明显差异（P&>0.05），空气压力至1.0MPa时，LDH的释放在30min后各时间点较对照组显示增加（P&<0.05），空气压力至1.5MPa时较对照组差异明显（P&<0.01）.
3 讨论
通过利用在体中枢神经系统损伤的动物模型的研究，对整个中枢神经系统损伤后的病理、生理以及神经功能变化取得了非常有意义的进展，对于功能以及行为变化的评估和损伤后总体治疗效果的研究，在体中枢神经系统损伤的动物模型是一个很有效的模型.但是，它不能够控制中枢神经系统各个细胞群的损伤并对其进行有效的观察和研究，随着细胞培养技术尤其是中枢神经细胞培养技术的进一步成熟，使得体外培养中枢神经细胞损伤模型的建立成为可能.Murphy等［10］ 于1993年开始用组织片及培养的中枢神经细胞进行体外损伤的实验研究已经取得了一些研究成果.
本实验模型可适用于中枢神经系统各细胞群机械性损伤的研究，也适用于机械性损伤后二次打击如缺氧等的研究，还可以利用本模型进行细胞群损伤后基因表达的研究.
参考文献:
［1］Tavalin SJ，Ellis EF，Satin LS.Inhibition of the electrogenic Na pump underlies delayed depolarization of cortical neurons after mechanical injury or glutamate ［J］.J Neurophysiol，1997;77（2）:632-638.
［2］Bleiberg J，Kane RL，Reeves DL，Garmoe WS，Halpern E.Factor analysis of computerized and traditional tests used in mild brain injury research ［J］.Clin Neuropsychol，2000;14（3）:287-294.
［3］Lee VM，Thibault LE.An in vitro model of traumatic neuronal injury:Loading rate-dependent changes in acute cytosolic calci-um and lactate dehydrogenase release ［J］.J Neurotrauma，1997;14（6）:355-368.
［4］Movsesyan VA，O’Leary DM，Fan L，Bao W，Mullins PG，Knoblach SM，Faden AI.mGluR5antagonists2-methyl-6-（pheny-lethynyl）-pyridine and （E）-2-methyl-6-（2-phenylethenyl）-pyridine reduce traumatic neuronal injury in vit-ro and in vivo by antagonizing N-methyl-D-aspartate receptors ［J］.J Pharmacol Exp Ther，2001;296（1）:41-47.
［5］Ostrow LW，Langan TJ，Sachs F.Stretch-induced endothelin-1production by astrocytes ［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2000;36（5Suppl1）:S274-S277.
［6］Nakayama Y，Aoki Y.Mechanism responsible for the formation of focal swellings on injured neuronal processes using a novel in vitro model of axonal injury ［J］.Forensic Sci Int，2000;113（1-3）:245-249.
［7］Situ ZQ，Wu JZ.Xibao Peiyang（Cell culture）［M］.Xi’an:Shijie Tushu Chuban Gongsi（World Publishing Corporation），1996:121-125.
［8］Ellis EF，Mckinney JS，Willoughby KA，Liang S，Povlishock JT.A new model for rapid stretch-induced injury of cells in cul-ture:Characterization of the model using astrocytes ［J］.J Neu-rotrauma，1995;12（3）:325-339.
［9］Jones KH，Senft AJ.An improved method to determine cell via-bility by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propi-dium iodide ［J］.J Histochem Cytochem，1985;33:77-79.
［10］Murphy EJ，Horrocks LA.A model for compression trauma:Pressure-induced injury in cell cultures ［J］.J Neurotrauma，1993;10（4）:431-444.
［11］McKinney JS，Willoughby KA，Liang S，Ellis EF.Stretch-induced injury of cultured neuronal，glial，and endothelial cells ［J］.Stroke，1996;27:934-940.
［12］Laplaca MC，Thibault LE.An in vitro traumatic injury model to examine the response of neurons to a hydrodynamically-induced deformation ［J］.Ann Biomed Eng，1997;25（4）:665-677.
［13］Rego AC，Areias FM，Santos MS，Oliveira CR.Distinct gly-colysis inhibitors determine retinal cell sensitivity to glutamate-mediated injury ［J］.Neurochem Res，1999;24（3）:351-358.
［14］Dubinsky JM，Rothman SM.Intracellular calcium concentra-tions during”chemical hypoxia”and excitotoxic neuronal injury ［J］.J Neurosci，1991;11（8）:2545-2551.
［15］Chaudieu I，Privat A.Neuroprotection of cultured fetal rat hip-pocampal cells against glucose deprivation:Are GABAergic neu-rons less vulnerable or more sensitive to TCP protection?［J］.Eur J Neurosci，1999;11（7）:2413-2421.转贴于