作者：葛伟 陈军 李源 陈会生
【关键词】 热痛敏
关键词: 老龄大鼠;持续性自发痛;机械性痛敏;热痛敏;蜜蜂毒试验;甲醛试验
摘 要:目的 观察老龄大鼠对一侧足底sc蜜蜂毒液（BV）或甲醛（F）诱致外周化学组织损伤的痛行为特点. 方法 应用持续自发缩足反射（PSFR）、热刺激缩足反射潜伏期（PWTL）和机械刺激缩足反射阈值（PWMT）痛反应定量检测方法，对老龄大鼠持续性自发痛和痛敏特点进行时程观察. 结果 ①老龄鼠的基础PWTL和PWMT均较青年成龄鼠高;②老龄大鼠一侧足底sc BV或F后也可引起PSFR，但与青年成龄动物相比BV诱致的PSFR数显著增多，但达到高峰的时间延迟30min，且反应时程大致相同.F诱致的PS-FR在反应形式和时程上都与青年成龄动物无显著差别，但是第二相PSFR数显著减少;③老龄大鼠一侧足底sc F不引起损伤部位PWTL缩短和PWMT降低，相反PWTL和PWMT显著增高以至对很强刺激无反应;④但是，老龄大鼠一侧足底皮下注入BV却可引起损伤部位PWTL和PWMT显著缩短或降低，初步时程观察发现BV诱致的热和机械性痛敏可持续数日以上，且后者的时程远长于前者. 结论 ①老龄大鼠热和机械痛阈均较青年成龄大鼠高;②外周组织损伤时，老龄大鼠持续性自发痛行为反应根据不同模型具有不同反应形式，但是总体表现为反应缓慢，强度弱;③sc BV诱致外周组织损伤时，老龄大鼠有显著的原发性热和机械性痛敏，但是sc甲醛后却不引起原发性痛敏，反而出现热和机械刺激反应缺失，提示两种痛模型在老龄也具有不同的发生机制.
Keywords:elderly rat;persistent spontaneous pain;mechan-ical hyperalgesia;heat hyperalgesia;bee venom test;formalin test
Abstract:AIM To observe pain-related response character-istics of elderly rats to peripheral chemical tissue injury in-duced by subcutaneous intraplantar injection with bee venom solution（BV）or formalin（F）.METHODS By using quan-titative measurements for persistent spontaneous paw flinch-ing reflex（PSFR），paw withdrawal thermal latency（PWTL）and paw withdrawal mechanical threshold（PWMT），time course and response characteristics of the persistent spontaneous pain and hyperalgesia of elderly and adult young rats were compared.RESULTS ①The elderly rats showed a significant increase in both PWTL and PWMT compared with the adult young rats.②The elderly rats re-ceiving s.c.BV or F could also express PSFR，however，the total number of the BV-induced PSFR was significantly in-creased and the peak response was delayed about30min after injection when compared with adult young rats.The response pattern and time course of the F-induced PSFR in elderly rats were similar to those of adult young rats，however，the num-ber of PSFR in F phase2response was significantly decreased in elderly rats.③Intraplantar F injection in elderly rats was not able to induce decrease in PWTL and PWMT，reversely，it resulted in an increase in PWTL and PWMT or loss of sen-sory response to high intensity stimuli.④Intraplantar BV injection in elderly rats，however，was able to induce de-crease in both PWTL and PWMT in the injured region lasting for several days and the duration for PWMT was significant longer than that for PWTL.CONCLUSION ①The heat and mechanical pain threshold in elderly rats are higher than those of adult young rats;②The persistent spontaneous pain-related behavioral response in elderly rats is likely to be different in different pain models of tissue injury and the acute pain response is generally slower and weaker than that in adult young rats;③The elderly rats show dramatic pri-mary heat and mechanical hyperalgesia following peripheral tissue injury by s.c.BV injection，however，the same treat-ment with F fails to produce either heat or mechanical hype-ralgesia，but causes a loss of heat and mechanical response，suggesting a difference in underlying mechanisms of the two pain models.
0 引言
近几年的研究显示人体实验性痛、临床急性和慢性病理痛都随年龄的变化而异，因此要求疼痛的治疗也应该具有相应的对策［1］ .但是，因为当前对疼痛年龄变化的特点和发生机制了解甚少，治疗上仍无相应对策.实验发现随着年龄增长，人的痛阈增高、痛耐受性降低以及对伤害性阈上刺激的辨别能力下降［1，2］ .当前对这些疼痛年龄变化特点的神经生物学机制尚无任何实验证据，原因是缺乏系统而深入的动物实验和模型.本研究的目的是应用两种比较成熟的动物病理痛模型 蜜蜂毒试验［3-8］ 和甲醛试验［9，10］ 对老龄和青年成龄大鼠基础热和机械刺激痛反射阈值、外周不同化学组织损伤诱致的持续性自发痛、原发性热和机械性痛敏的行为特点进行比较分析，以此为进一步研究这些行为特点的神经生物学基础提供实验模型.
1 材料和方法
1.1 材料 ①健康自然饲养老龄（大于20mo龄）雄性SD大鼠20只（西安交通大学医学院实验动物中心），体质量500～600g;②健康青年成龄雄性SD大鼠20只（第四军医大学实验动物中心），体质量180～220g.实验过程中每只动物单独饲于塑料盒中，室温22℃～26℃，为了保持动物昼夜生物节律，实验室每日8:00～20:00开灯，20:00～8:00熄灯，行为学实验均在9:00～18:30之间进行.实验前5d每日将大鼠置于实验观察箱中30min，使之适应.本实验是严格按照IASP关于应用清醒动物进行疼痛实验研究纲要的要求来实施和完成的［11］ .将老龄大鼠随机分为2组:实验组1:左足底sc蜜峰毒液（bee venom，BV）组（n=10）;实验组2:左足底sc甲醛（Formalin，F）组（n=10）.将成年大鼠也随机分为2组作为对照:对照组1:左足底sc BV组（n=10）;对照组2:左足底sc F组（n=10）.
所用BV溶液是将粗制冻干蜜蜂毒素（美国Sig-ma公司）溶于9g L-1 生理盐水制成，采用质量浓度 为4g L
-1 ，体积为50μL［3-8］ .F溶液是用9g L-1 生理盐水溶解化学纯多聚甲醛配制9.25g L-1 溶液，配制成浓度25mL L-1 的溶液，体积50μL.测痛的实验器材为RTY-3型自动热刺激仪（西安峰岚仪器厂）及von-Frey纤毛机械刺激器（刺激强度由大到小依次为:150，120，90，60，45，39.5，37，36，30，26.5，19，12，9.5，8.0，5.8，3.7，1.7，1.0，0.6和0.3g）.
1.2 方法
1.2.1 BV与F致痛模型的建立 根据本实验室以往的报道［3，5，6］ ，实验者轻轻地固定大鼠，用26G×5/8皮针连接1mL注射器，尽快地将50μL的BV或F注入其左后肢足底中心皮下，注入后立即定量观察动物自发性痛反射行为（5min自发缩足反射次数）.致痛剂注射前或2h后用辐射热刺激仪或von-Frey机械刺激器测试注射侧足底热刺激缩足反射潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）和机械刺激缩足反射阈值（paw withdrawal mechanical thre-shold，PWMT）.BV或F注射完毕后，分别对持续自发痛缩足反射、PWTL和PWMT的变化程度与时程（给药后2，4，8，24，48，72及96h）进行定量评价.
1.2.2 PWTL评价法［3-5］ 将大鼠置于一底部为2mm厚玻璃板的20cm×20cm×25cm的透明有机玻璃箱中，并放置于高于实验台30cm的架子上以便观察，待测大鼠于箱中适应30min以上，使之从不安到逐渐安静下来.应用RTY-3型辐射热刺激仪，内装100W卤素投射灯，调节电压至10V，调节灯源与玻璃板之间的距离，使落在足底的照射光圈直径为5mm，记录从照射开始至出现缩足逃避反射时间（s），此即为PWTL;重复测量3～5次，同一部位间隔10min，不同部位间隔5min，取PWTL平均值.如果大于40s大鼠仍无反应则停止照射，以免导致足底组织热损伤.
1.2.3 PWMT评价法［3-5］ 以不同粗细和长度的尼龙丝制成17个刺激强度不同（0.3～45g）的von-Frey机械刺激器.将一20cm×20cm×25cm的透明有机玻璃箱放置于顶部为铁丝网高30cm的架子上，实验者手持von-Frey纤维穿过铁丝网格分别刺激大鼠两侧足底中心部位，刺激由小到大，每个强度反复刺激10次（次-次间隔3～5s），将出现缩足反射5次左右的强度定为PWMT.
统计学处理:实验结果以x ±s表示，应用方差分析（ANOVA Fisher’s PLSD）做统计学处理.
2 结果
2.1 基础PWTL和PWMT 老龄鼠的基础PWTL和PWMT分别为（17.91±2.29）s和（67.29±10.74）g，而青年成龄鼠的基础PWTL和PWMT分别为（11.95±1.03）s和（30.82±7.13）g，两组经统计学比较具有显著差别（每组n=20，P&<0.01）.
2.2 持续自发痛反应 用BV和F两种持续自发痛模型进行检测，结果显示老龄鼠持续自发痛反应与成龄鼠有一定区别.与青年成龄鼠相比，sc BV后老龄鼠注射侧每5min自发缩足反射平均次数显著增加（43.75±6.26vs31.94±3.04，每组n=10，P&<0.01），持续时程约1～2h，但不同的是反射次数在BV注射即刻较青龄鼠少，尔后逐渐增多，且达到峰值时间延迟了30min.老龄鼠与青年成龄鼠在F第1相持续自发痛反应期（0～10min）无显著差别，但是在第2相反应期（11～50min）前组显著少于后组（37.36±6.73vs58.38±6.85，每组n=10，P&<0.01）.老龄鼠在F反应模型中时程和形式无变化.
2.3 BV诱致原发性热痛敏与机械痛敏 与成龄鼠相似，老龄鼠足底sc BV后也可导致注射侧后足底PWTL和PWMT显著降低，与基础值相比下降了50%～60%.时程观察发现PWTL降低可持续8～24h，但和PWMT降低持续72～96h以上.
2.4 F诱致热刺激和机械刺激反应 老龄鼠足底sc F后，注射处PWTL和PWMT均升高，甚至反应消失.
3 讨论
本研究首次对老龄和青年成龄大鼠对外周不同化学组织损伤诱致的持续性自发痛、原发性热和机械性痛敏的行为特点进行了比较分析，发现:①与青年成龄大鼠相似［3-6，9，10］ ，老龄大鼠对外周sc BV或F所诱致的化学组织损伤具有不同的持续自发痛行为反应形式，BV和F均可诱致持续自发缩足反射行为，但是前者的反应形式为单相性，而后者的反应形式为双相性，提示两个持续痛反应模型的反应形式无显著年龄差别;②但是，老龄大鼠持续自发痛行为反应的高峰时间和强度（自发缩足频数）与青年成龄大鼠存在显著年龄差别，而且具有模型间的差异.如与青年成龄大鼠相比，老龄大鼠一侧足底sc BV后诱致的自发缩足反射次数达到高峰的时间显著延迟30min左右，反应次数随时程逐渐显著增多.但是，F诱致的自发缩足反射第一相和第二相均无显著时间延迟，第一相反射频数也无年龄差异;但第二相自发缩足反射数减少，具有显著年龄差异.这个结果提示外周不同化学组织损伤所诱致的持续自发痛反射行为具有年龄差异，而且在老龄动物两种痛模型所表现出 来的最强痛反应发生时间和强度都不相同，建议研究痛的年龄变化必须同时用多种痛模型比较研究才可能得出可靠的实验结果和结论;③与青年成龄大鼠相似［3，5，6］ ，老龄大鼠对外周不同化学组织损伤所诱致的刺激诱发痛敏感性改变不同，如老龄大鼠一侧足底sc F不引起损伤部位PWTL缩短和PWMT降低，相反PWTL和PWMT显著增高以至对很强刺激无反应，提示F导致了外周组织感受器的灭活或损伤;但是老龄大鼠一侧足底sc BV却可引起损伤部位PWTL和PWMT显著缩短或降低，且时程可持续数日以上，提示BV可诱发原发性热和机械痛敏或触诱发痛（Allodynia）;④与青年成龄大鼠不同，老龄大鼠原发性热痛敏和机械痛敏的时程不同，后者远长于前者，提示原发性机械痛敏和触诱发痛具有年龄差异且老龄动物更易慢性化;⑤老龄大鼠基础热和机械痛阈均较青年成龄大鼠高，这个结果与人的实验结果相似［1］ ;⑥从年龄变化的结果基本一致性来看，BV和F两种痛模型在老龄和青年成龄大鼠的表现均不同，强烈提示痛模型间存在差异性和发生机制的多样性，这与我们以往发现的结果完全一致［8］ .
关于年龄因素对痛反应和痛感受的影响，已有一些人和动物的实验报道.年龄增长对躯体感觉皮质诱发电位传导速度有显著影响［12］ ，老龄人对皮肤辣椒素刺激诱发自发痛出现的报告时间也较青年成人延迟12s左右［13］ ，老龄鼠热板试验潜伏期显著延长［14］ ，此外动物实验结果还显示外周神经纤维可随年龄增长脱髓鞘，同时髓鞘蛋白基因下调［15］ ，这些结果似乎可以解释为什么大鼠年龄增长伴随基础热和机械痛阈增高以及对外周组织损伤诱发的自发痛感知的潜伏期延长的原因.
［17，18］ .这提示老龄痛敏时程延长可能与下行痛抑制系统的减弱有一定关系.但是根据青年成龄动物实验研究的结果，我们推测更重要的是外周组织损伤时脊髓初级传入冲动的不断传入可使脊髓背角伤害性神经元如广动力域（WDR）神经元兴奋性增高、敏感性增强，这一过程首先由初级传入终末释放谷氨酸和神经肽如P物质，导致NMDA/AMPA/NK受体和VDCC通道激活，胞内Ca2+ 增高，进而胞内蛋白激酶（PKC，PKA，PKG）、环氧合酶2-PGE2等信号转导系统激活，进一步使WDR神经元对机械刺激敏感性增强，反应时程延长（中枢敏化机制）［8，19］ .近来的实验还证明下行痛易化系统的活性增强和脊髓内部抑制神经递质和受体活性的减弱也可能参与痛敏持续慢性化的过程［19］ .
致 谢 本实验在第四军医大学基础部解剖学教研室暨梁钅求琚脑研究中心完成，得到该室和疼痛研究组全体同事的大力协助和支持.
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