作者：赵晶 许彦鸣 贾林涛 于翠娟 陈蕾 黄威权 王成济 杨安钢
【关键词】 基因表达
关键词: granzyme B;基因表达;HeLa细胞
摘 要:目的 构建携带人granzyme B基因的真核表达载体，并将其在HeLa细胞中表达. 方法 用反转录PCR获取人granzyme B全长cDNA序列，将其活性型序列克隆进pcD-NA3重组表达质粒.脂质体法转染HeLa细胞，间接免疫荧光检测目的蛋白表达，HE染色观察其对转染HeLa细胞形态的影响. 结果 成功获得了野生型granzyme B cDNA，构建了编码活性型granzyme B的真核表达载体pcDNA3-G.转染HeLa细胞后观察到目的蛋白表达，转染细胞形态发生变化，出现多核大细胞及固缩小细胞. 结论 活性型granzyme B哺乳动物表达系统的建立，为进一步研究granzyme B的生物学效应奠定了基础.
Keywords:granzyme B;gene expression;HeLa cells
Abstract:AIM To construct eukaryotic expression vector carrying human granzyme B gene and express it in HeLa cells.METHODS RT-PCR was used to obtain human granzyme B cDNA.Then the recombinant expression vector pcDNA3-G was constructed by cloning active ganzyme B into eukaryotic expression vector pcDNA3.After transfection into HeLa cells through lipofectamine2000
TM ，the expression of target gene was detected by indirect immunofluorescence as-say and its effect on HeLa cells was observed by HE staining.RESULTS The obtained human granzyme B cDNA was con-sistent with that in GenBank.The eukaryotic expression vec-tor pcDNA3-G encoding active granzyme B was successfully constructed and expressed in HeLa cells.Some transfected cells grew bigger than the control，often with multiple nuclei，while others exhibited condensed nucleus and cyto┐plasm.CONCLUSION The establishment of mammalian expression system of active granzyme B is of significance in further research for granzyme B.
0 引言
granzyme B，即颗粒酶B，是杀伤性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞颗粒（granule）中最重要的丝氨酸蛋白酶，在颗粒介导的靶细胞凋亡中起关键作用［1，2］ .它最初以酶原形式合成，在内质网中加工除去N端信号肽后，贮存于CTL的颗粒中.当CTL接受抗原刺激时，granzyme B被切除N端酸性二肽，成为活性型granzyme B［3］ .活性型granzyme B通过穿孔素或受体进入靶细胞，广泛切割含Asp-X，Glu-X位点的多种底物蛋白，引起细胞凋亡［4-8］ .目前对其促凋亡功能的研究局限于纯化granzyme B天然或重组蛋白，或分离表达granzyme B的CTL，体外与靶细胞孵育.我们克隆获得了人granzyme B全长cDNA序列，并将活性型序列转染HeLa细胞，观察表达产物对转染细胞的直接效应.
1 材料和方法
1.1 材料 pUC19质粒、pcDNA3质粒、E.coli DH5α宿主菌和人宫颈癌细胞系HeLa均为本室保存;淋巴细胞分离液为华美公司产品;PHA-P购自Sigma公司;限制性内切酶、Taq酶、反转录试剂盒、RPMI1640，DMEM，新生牛血清及脂质体lipofec-tamine2000TM 均购自Gibco公司;T4 DNA连接酶为TaKaRa产品;plasmid purification kit购自上海华舜公司;山羊抗人granzyme B多克隆抗体为Santa Cruz产品;生物素化兔抗山羊二抗及SABC-Cy3为博士德产品;测序试剂盒购自PE公司.
1.2 方法
1.2.1 人granzyme B cDNA的获取及克隆 用淋巴细胞分离液分离健康人外周血单个核细胞，0.015g L-1 PHA-P刺激培养72h，加Trizol试剂提取总RNA.设计引物GRBF，GRBR，序列如下.GRBF为:5’-TTTGGATCCATGCAACCAATCCTGCT-TCT-3’;GRBR为:5’-TTTGAATTCTTAGTA-GCGTTTCATGGTTT-3’.以GRBR为引物，按试剂盒说明书反转录出cDNA第一链，用GRBF和GRBR引物PCR得到granzyme B双链cDNA.BamHI，EcoRI双酶切PCR产物及pUC19质粒，连接、转化入E.coli DH5α，酶切鉴定后测序，重组克隆质粒命名为pUC19-GrB.
1.2.2 活性型granzyme B基因的真核表达载体构建 设计引物GF和GR，GF为:5’-TTTGAATTC-ATGATCATCGGGGGACATGAGGC-3’;GR为:5’-TTTTCTAGAGGATCCTTAGTAGCGTTTC-ATGGTTTT-3’.以pUC19-GrB为模板，PCR获得除去N端信号肽及酸性二肽的活性型granzyme B基因，以EcoRI，XbaI双酶切后克隆入pcDNA3相应位点，酶切鉴定并测序证实，重组表达质粒命名为pcDNA3-G.
1.2.3 pcDNA3-G质粒的转染及其表达鉴定 转染前将对数生长的HeLa细胞重铺于6孔板中，待细胞长至80%覆盖率时进行转染.取3μg DNA，6μL lipofectamine2000TM 各加入100μL无血清DMEM中，轻轻混合，室温孵育20min.细胞用无血清DMEM洗2次，加800μL无血清DMEM，滴加转染液，37℃，50mL L-1 CO2 培养8h后弃转染液，换含100mL L-1 小牛血清的DMEM继续培养.同时设置未转染HeLa对照及转染pcDNA3空载体对照.转染后8h消化转染细胞，适量滴加至预先酸处理过的盖玻片上，37℃，5mL L-1 CO2 放置1h使细胞贴壁，补加足量培养液继续培养至48h取出盖玻片.PBS（pH7.4）洗2次，40g L-1 多聚甲醛固定30min，PBS再洗2次，经0.1mL L-1 Triton孵育，血清封闭等处理后，依次加入1 200稀释的山羊抗人granzyme B蛋白多克隆抗体，1 100稀释的生物素化兔抗山羊二抗，1 100稀释的SABC-Cy3，激光共聚焦显微镜观察并照相，激发波长为554nm，发射波长为568～574nm.
1.2.4 pcDNA3-G转染细胞的HE染色 取出转染后72h的HeLa细胞爬片，经苏木素染色，盐酸乙醇分色，伊红复染，脱水透明，封片照相.
2 结果
2.1 RT┐PCR获取人granzyme B cDNA 提取健康人外周血单个核细胞的总RNA，反转录合成cDNA，以GRBF和GRBR引物扩增出约760bp的片段（Fig1）.将其克隆入pUC19后酶切鉴定（Fig2），并进行序列测定，结果与GenBank中人granzyme B序列完全一致.
图1 － 图2 略
2.2 活性型granzyme B基因的扩增及其真核表达载体构建 以pUC19-GrB为模板，用GF和GR引物扩增获得约700bp的活性型granzyme B基因（Fig3），克隆入pcDNA3后双酶切鉴定（Fig4）.测序结果表明所获序列完全正确. Lane1:DL2000marker;Lane2:Active granzyme B gene.
图3 略
2.3 pcDNA3┐G在HeLa细胞中表达的鉴定 转染后48h取出HeLa细胞爬片，进行间接免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，pcDNA3-G转染组检测到granzyme B在胞质中表达（Fig5）.
2.4 活性型granzyme B对转染HeLa细胞形态的影响 转染目的基因72h后的HE染色结果表明，与转染pcDNA3空载体组相比，pcDNA3-G转染组出现多核大细胞，以及细胞质和细胞核固缩的小细胞（Fig6）.
3 讨论
granzyme B属于丝氨酸蛋白酶家族，在CTL和NK细胞介导的靶细胞凋亡中发挥重要作用.目前对其功能的研究方法是纯化天然granzyme B蛋白，或提纯细菌、酵母、昆虫表达系统生产的重组granzyme B蛋白，或分离表达granzyme B的CTL，与靶细胞孵育.Smyth等［9］ 虽构建granzyme B活性型与非活性型（含酸性二肽）的真核表达载体，并在哺乳动物COS细胞中瞬时表达，但也仅检测了其切割底物的生化性质，未涉及表达的granzyme B对转染细胞自身的形态学观察.Bochan等［10］ 将granzyme B和perforin（穿孔素）的反义核酸稳定转染特定的CTL，观察到可显著抑制颗粒介导的靶细胞凋亡作用.Pinkoski等［11］ 把活性型granzyme B蛋白显微注射入MCF-7细胞的胞质内，可诱导靶细胞发生凋亡.尚未见granzyme B基因异位表达及对转染细胞的形态学研究.
granzyme B最初以酶原合成，在内质网中切除信号肽后，在CTL的颗粒中稳定贮存.当CTL识别靶细胞膜表面抗原时，granzyme B被颗粒中的二肽酰肽酶I（dipeptidyl peptidase I）加工去除N端酸性二肽，成为活性形式.活性型granzyme B通过穿孔素或受体进入靶细胞，在胞质及胞核中切割含Asp-X，Glu-X位点的多种结构和功能蛋白，导致细胞凋亡.表达granzyme B的CTL采取自我保护机制预防自杀，而靶细胞接受外源的活性型granzyme B走向死亡.把活性型granzyme B异位表达于HeLa细胞，观察表达产物对转染细胞的直接作用，将为granzyme B功能研究开辟新的途径.
我们将去除N端信号肽和酸性二肽的活性型granzyme B基因转染人HeLa细胞，观察到异位表达活性型granzyme B的部分细胞体积增大，甚至出现多核现象.HE染色进一步观察，多核的大细胞与胞质、胞核固缩的小细胞同时并存.上述结果提示异位表达的活性型granzyme B分子对细胞可能存在较复杂的作用机制.
参考文献:
［1］Trapani JA.Dual mechanisms of apoptosis induction by cytoto-xic lymphocytes ［J］.Int Rev Cytol，1998;182:111-192.
［2］Trapani JA，pis J，Sutton VR，Smyth MJ.Proapoptotic func-tions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo ［J］.Curr Opin Immunol，2000;12:323-329.
［3］Pham CT，Ley TJ.Dipeptidyl peptidase I is required for the processing and activation of granzyme B in vivo ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96（15）:8627-8632.
［4］Harris JL，Peterson EP，Hudig D，Thornberry NA，Craik CS.Definition and redesign of the extended substrate specificity of granzyme B ［J］.J Biol Chem，1998;273（42）:27364-27373.
［5］Estebanez-Perpina E，Fuentes-Prior P，Belorgey D，Braun M，Kiefersauer R，Maskos K，Huber R，Rubin H，Bode W.Crys-tal structure of the caspase activator human granzyme B，a pro-teinase highly specific for an Asp-P1residue ［J］.Biol Chem，2000;381（12）:1203-1214.
［6］Jia LT，Yu CJ，Xu YM，Zhu F，Peng WD，Su CZ，Wang CJ，Yang AG.Construction and effect of caspase-3fusion proteins and their apoptosis induction in HeLa cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（12）:1057-1060.
［7］Bai QY，Huang GS，Wang Z，Zhang XH.bcl-xL gene confers multidrug resistence in leukemia cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（1）:45-47.
［8］Zhang HL，Wang WL，Hu LZ.Detection of the mutation of p53and K-ras genes and expression products ［J］.Di-si Junyi Da-xue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（9）:769-771.
［9］Smyth MJ，McGuire MJ，Thia KY.Expression of recombinant human granzyme B.A processing and activation role for dipep-tidyl peptidase I ［J］.J Immunol，1995;154（12）:6299-6305.
［10］Bochan MR，Goebel WS，Brahmi Z.Stably transfected anti-sense granzyme B and perforin constructs inhibit human granule-mediated lytic ability ［J］.Cell Immunol，1995;164（2）:234-239.
［11］Pinkoski MJ，Hobman M，Heibein JA，Tomaselli K，Li F，Seth P，Froelich CJ，Bleackley RC.Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis ［J］.Blood，1998;92（3）:1044-1054.