作者：洪伟，王禾，石炳毅，沈瑞雄，柏宏伟，李州利，周文强
【关键词】 淋巴细胞
【关键词】 淋巴细胞，功能相关，抗原1；CD11a；髓，过氧化酶；肾，缺血再灌注，损伤
【Abstract】 AIM： To investigate the change of CD11a and myeloperoxidase (MPO) content during rat renal ischemia-reperfusion injury (IRI)， as well as the role of LFA1 in renal IRI. METHODS：We utilized the rat model of renal IRI to detect the renal tissue contents of CD11a and MPO. RESULTS： Level of CD11a and MPO was very low in normal renal tissue， but was increased significantly in those of ischemia reperfusion. And this level in the ischemia 60 min reperfusion group was higher than that in ischemia 30 min reperfusion group. CONCLUSION： Level of CD11a and MPO in rat renal tissue increased significantly during rat renal IRI. LFAK1 mediated leukocyte adherence plays an important role in renal IRI.
0 引言
肾脏缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）与急性肾功能衰竭和移植肾功能恢复有密切关系，其机制并未十分清楚，近年研究认为粘附分子及其介导的中性粒细胞与内皮细胞的粘附在IRI中起着重要的作用［1］.我们利用大鼠肾脏缺血再灌注模型，观察肾缺血再灌注后CD11a的表达以及髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的变化，探讨淋巴细胞功能相关抗原1(lymphocyte function associated antigen1， LFA1)在肾脏IRI的作用.
1 材料和方法
1．1 动物分组和模型制作 健康雄性SD大鼠45只，体质量（210±20） g（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），随机分为假手术对照组、缺血30 min组和缺血60 min组，缺血组又再分为再灌注0，24，48和72 h组，每组5只.用速眠新（0.8 mL・kg-1体质量） im麻醉，正中剖腹，切除右肾，游离左肾蒂，以无损伤动脉夹夹闭左肾动脉30 min或60 min后松开动脉夹，若左肾灌注后由暗黑转为红润，表示灌注成功，关闭切口.假手术对照组仅游离左肾蒂，但不钳夹.分别于缺血终点（即再灌注0 h），再灌注后24，48，72 h后取左肾，迅速投入液氮中速冻备用.
1．2 髓过氧化酶（MPO）测定 采用黎君友等改良的方法检测肾组织MPO活性［2］，称取冰冻标本100 mg加1 mL磷酸钾缓冲液（20 mmol・L-1，pH 7.4），冰浴匀浆后离心（35 000 g，30 min，4℃）.弃上清，加入1 mL 50 g・L-1溴化十六烷基三甲胺（HTAB），混匀后-70℃保存.取出融化后，超声破碎2 min，60℃水浴2 h后离心（35 000 g，10 min，4℃）；取上清0.1 mL，加入2.9 mL反应液(含1.67 g・L-1邻联大茴香胺及0.005 mL・L-1 h3O2)， 混匀后于460 nm处测30 s和90 s的A值.MPO活性（U・g-1）=ΔA×13.5.
1．3 肾组织CD11a表达检测 采用免疫组化链霉亲和素-生物素（SABC）法染色并进行半定量分析，主要步骤为：① 冰冻切片用丙酮固定30 min，蒸馏水洗；② 用5 mL・L-1h3O2甲醇液阻断内源性氧化酶30 min，蒸馏水洗3次；③ 滴加正常兔血清封闭液，室温20 min.甩去多余液体，不洗；④ 滴加1∶50稀释的小鼠抗大鼠CD11a单克隆抗体（购自晶美公司为英国Serotec公司产品），4℃过夜.0.1 mmol・L-1 PBS洗2min×3次；⑤ 滴加生物素化兔抗大鼠IgG，37℃ 20 min.0.1 mmol・L-1 PBS洗2 min×3次；⑥ 滴加试剂SABC，37℃ 20 min.0.1 mmol・L-1 PBS洗5 min×4次；⑦ DAB显色（DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司）：取1ML蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各一滴，混匀后加至切片.室温显色，镜下控制反应时间，一般在2~3 min之间.蒸馏水洗涤；⑧ 苏木素轻度复染.脱水，透明，封片.显微镜观察.阴性对照试验用PBS代替一抗，其余步骤相同.每个标本随机选取10个高倍视野（×20），使用北京天地电子科技公司TD2000真彩色病理显微图像分析系统进行图像分析，取阳性细胞占视野的百分比进行统计，先将所得的百分数进行变量变换，用反正弦函数变换法［3］，具体公式为：x=sin-1(X)1/2.变换后取每个标本的平均值进行统计分析.
统计学处理：所有数据以x±s表示，采用第四军医大学开发的SPLM统计软件处理实验数据，并进行方差分析，差异显著性标准为P&<0.05.
2 结果
2．1 肾组织MPO活性 正常肾组织和单纯缺血组中MPO活性极低，再灌注后各组MPO活性均显著高于对照组（P&<001）.缺血60 min再灌注后各组与同一时间点缺血30 min组比较MPO均显著升高（P&<001，表1），肾组织MPO活性于缺血再灌注24 h 达高峰，并随再灌注时间的延长而逐渐下降.
2.2 肾组织CD11a的表达 正常肾组织中CD11a的表达极低，但是在缺血后即开始表达，再灌注后各组表达均显著高于对照组（P&<001）.缺血60 min再灌注0，24，48 h组的CD11a的表达显著高于同一时间点缺血30 min组（P&<001，表1）.
3 讨论
肾脏IRI是导致急性肾功能衰竭和影响移植肾存活时间的重要因素之一，而严重的IRI又是导致移植肾功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）的主要原因［4］.现已知造成和/或参与肾IRI的相关因素很多.近年研究表明，由粘附分子介导的白细胞与肾血管内皮细胞相互粘附作用形成的粘附级联反应是白细胞聚集、活化、释放炎症介质的关键，并在肾脏IRI中起重要作用［5］.CD11a作为粘附分子整合素αL亚单位，与整合素β2亚单位CD18一起组成LFA-1，它表达于淋巴细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，记忆T细胞LFA-1表达水平升高.LFA-1是重要的细胞间粘附分子，是炎症早期介导白细胞向肾血管内皮细胞粘附的关键成分.并通过CD54-CD11a/CD18形式的连接，使白细胞与肾血管内皮细胞发生牢固粘附［6，7］，导致微血管堵塞，发生无复流现象，白细胞还通过粘附作用，跨内皮细胞浸润到缺血周围组织，引起组织局部释放更多的炎性介质，如细胞因子、蛋白酶、弹性蛋白酶、髓过氧化物酶（MPO）以及其他酶类，增强上述粘附分子的表达及亲和力，促进中性粒细胞与肾血管内皮细胞的粘附及其激活与浸润，进一步释放炎性介质，导致更多的中性粒细胞激活、浸润，通过直接损伤组织，破坏血管内皮细胞的功能，引起肾小血管梗阻，从而引起肾脏IRI［8］.MPO是中性粒细胞聚集的特征酶，可使h3O2和Cl-形成次氯酸，对组织细胞有明显的毒性，通过对MPO活性的测定可较明确地反应中性粒细胞聚集的程度.本研究发现，大鼠肾脏缺血再灌注后早期CD11a表达即有显著增强（与假手术对照组比较P&<001），并且缺血60 min组的CD11a表达显著高于缺血30 min组（P&<001）.进一步发现MPO活性在缺血再灌注后逐渐增强，并于24 h达高峰，缺血60 min组的MPO活性亦显著高于缺血30 min组（P&<001）.本实验结果表明LFA-1是肾脏缺血再灌注中介导白细胞启动炎症过程和参与肾IRI的重要因素，同时也表明缺血时间延长会明显加重对肾脏的损伤程度.因此在临床工作中应尽量避免肾脏IRI，尤其在肾移植工作中，肾脏IRI虽然是不可避免的，但是至少应尽量缩短肾脏热缺血和冷缺血时间，减轻肾脏的损伤，避免DGF.总之，本实验研究对进一步阐明肾IRI机制以及在临床上探讨防治急性肾功能衰竭和延长移植肾存活时间有重要的参考意义.
参考文献
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