作者：韩岩， 鲁开化，杨力，张辉
【关键词】 层粘连蛋白
【Abstract】AIM：To detect the influence of laminin and type IV collagen on the axon growth of the cultured spinal neuron. METHODS: Laminin and collagen IV were used in the experimental group and laminin and collagen IV combined with associated antibody， collagen I and polylysine were used in the control groups. Spinal neuron cells of the same density were cultured in each group. Each group was stained by the immunochemical method of Neuron-specific Enolase (NSE) and the length of the neuron axons was measured by the computer image system. RESULTS: The spinal neuron cells and their axons were stained by NSE. The axons length of the laminin and collagen IV groups was longer than that of other groups but no significant difference was observed. CONCLUSION: Laminin and collagen IV can stimulate the axon growth of spinal neuron cells.
【Keywords】 laminin；collagen；Neurons
【摘 要】目的： 观察基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原在体外培养条件下对脊髓神经细胞突起生长的作用.方法: 用基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原包被培养板，以结合了相应抗体的培养板及包被I型胶原和多聚赖氨酸的培养板为对照，将培养的脊髓细胞以相同浓度加入各组培养板内.培养5 d后将各组细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组化染色，利用计算机图像分析技术测定各组神经元突起的长度并进行统计学分析.结果: 免疫组化染色可见各组均有较多的神经细胞及其突起生长，统计分析结果表明基膜粘连蛋白组与Ⅳ型胶原组间神经元突起生长长度无显著差异，基膜粘连蛋白组神经元突起生长长度长于其它各组.Ⅳ型胶原组神经元轴突生长长度与 I型胶原组间无显著差异，与多聚赖氨酸组有显著性差异.基膜粘连蛋白组和Ⅳ型胶原组神经元轴突生长情况优于相应的抗体组.结论: 基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原均可促进脊髓神经元突起的生长.
【关键词】 层粘连蛋白;胶原;神经元
0 引言
细胞外基质成分能够促进神经细胞轴突的生长和髓鞘的形成［1］.基膜粘连蛋白和Ⅳ型胶原是细胞外基质的重要组成成分，对神经细胞的生长、发育等方面起着重要的作用［2，3］.在动物实验研究中我们观察到该两种物质能够促进周围神经的再生［4］，为进一步了解它们对神经细胞突起生长的直接作用，我们从形态学上观察了基膜粘连蛋白和IV型胶原对培养条件下脊髓神经细胞突起生长的作用.
1 材料和方法
1. 1 实验分组 实验分为6组：基膜粘连蛋白组（LN组），抗基膜粘连蛋白组（antiLN组），Ⅳ型胶原组（Col Ⅳ组），抗Ⅳ型胶原组（antiCol Ⅳ组），I型胶原组（Col Ⅰ组），多聚赖氨酸组（poly组）.
各组用相应的底物包被培养板.① LN 组：按1 μg・cm-2的量将基膜粘连蛋白（GIBCO/BRL）均匀地涂于培养板上.② AntiLN组：于包被好的LN组培养板内加入抗基膜粘连蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），工作浓度1∶2000，37℃孵育过夜.③ Col Ⅳ组：按1 μg・cm-2的量将Ⅳ 型胶原蛋白（GIBCO/BRL）均匀地涂于培养板上.④ AntiCol Ⅳ组：于包被好的Col Ⅳ组培养板内加入抗Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），工作浓度1∶2000，37℃孵育过夜.⑤ Col I组：按1 μg・cm-2的量将I 型胶原蛋白（Sigma）均匀地涂于培养板上.⑥ Poly组：将浓度为20 μg・mL-1的多聚赖氨酸（Sigma）均匀地涂于培养板上.
将以上各组培养板放置于37℃孵箱内24 h备用.
1．2 脊髓细胞分组培养 无菌条件下切取胎龄为18 d的昆明小鼠脊髓，参考杨大莉等［5］报道的方法进行细胞培养，于解剖显微镜下小心剥离脊髓，剥净血膜，剪碎组织至1 mm×1 mm×1 mm，125 g・L-1胰酶(Sigma)消化，37℃，25 min. 用完全培养液(DMEM 含胎牛血清、马血清各100 mL・L-1， Sigma)终止消化10 min. 用N1培养液( DF12培养液中含胰岛素5 mg・L-1、转铁蛋白5 μg・L-1、硒酸钠5 μg・L-1、黄体酮002 mmol・L-1)洗组织，吹打制成单细胞悬液，以2×105 ・mL-1的密度分别接种于24孔各组培养板内，每孔的悬液量为05 mL.静置培养48 h，换用马血清培养液(Sigma)，加入阿糖胞苷（Arac Sigma），浓度10 μmol・L-1，作用24 h，抑制胶质细胞的生长.第5 日时终止培养，PBS洗去培养液，加入40 g・L-1多聚甲醛，4℃固定2 h，PBS洗3遍后加入80 g・L-1蔗糖液保存标本.
1．3 免疫组织化学染色 将固定的标本用PBS洗3遍，每遍3 min，30 mL・L-1甲醇双氧水封闭内源性过氧化酶的活性15 min，PBS洗3遍，1/50正常羊血清孵育20 min，加入神经元特异性烯醇化酶抗体（NSE 1∶500 Sigma）4℃孵育48 h，PBS洗3遍；加入生物素化的第二抗体（马抗兔IgG 1∶200），4℃孵育24 h；PBS洗3遍，加ABC复合物4℃ 4 h；PBS洗3遍，DBAh3O2 液显色；PBS洗3遍，甘油明胶液封存标本.
1．4 突起长度的测量 各组染色后的标本置于CAMERA LUCIDA 绘图显微镜下绘出染色阳性的胞体和突起的形状，每组3份标本.所绘制的细胞图要求胞体及突起与其他的胞体和突起相互无重叠、聚集和交叉.将所绘制的各组细胞图用QUANTMENT S70图像分析仪进行图像分析，分别计算出各组每个单、双极神经元突起的长度.
统计学处理：采用SPSS11.0软件作方差分析，多组均数间的比较采用最小显著差法.
2 结果
2. 1 神经元特异性烯醇化酶染色结果 神经细胞及其突起被染成棕黑色，光镜下神经细胞胞本呈圆形或椭圆形.大都有突起长出，呈线状向周围弯曲延伸（Fig 1）.
2．2 各组突起长度的测量结果 见Tab 1.
经统计学分析，单极神经元各组间有显著差异（F=1558，P=0000）和双极神经元各组间有显著差异（F=1521，P=0000），结果表明LN组与Col Ⅳ组之间两种神经元突起生长长度无显著差异(P&>005)，LN组与其他各组均有显著差异(P&<001)；Col Ⅳ组两种神经元突起生长长度与Col Ⅰ组间有显著差异(P＜001)，与Poly组间有显著差异(P&<001)；Col Ⅰ组与Poly组间两种神经元突起生长长度无显著差异(P&>005)；LN组与antiLN组、Ⅳ组与antiCol Ⅳ组之间两种神经元突起生长长度均有显著差异(P&<001).
图1 培养5 d后脊髓神经元的胞体和突起（略）
表1 各组单、双极神经元突起测量长度（略）
Tab 1 Measured length of neuron axons in different groups(略)
3 讨论
各种细胞外基质成分对神经细胞的生长都起着一定的作用［6，7］，从本结果来看LN在促进脊髓神经元突起生长方面的作用比较明显，培养5 d后LN组突起的生长长度明显要比I型胶原和多聚赖氨酸组长，加入LN抗体后突起的生长明显地受到了抑制，说明LN对突起的生长起直接的作用.
Ⅳ型胶原对突起生长的作用虽然与Ⅰ型胶原组相比差异不大，但其作用要较多聚赖氨酸组明显.同LN组一样，加入抗Ⅳ型胶原抗体后Ⅳ型胶原促进突起生长的作用也受到了明显的抑制.说明Ⅳ型胶原也有直接促进突起生长的作用.
目前认为LN和Ⅳ型胶原之所以能够促进突起的生长是因为神经细胞表面存在着能与它们功能基团相结合的受体［8，9］，当受体与这些功能基团结合后，受体调节神经细胞内的肌动蛋白丝，使其在细胞的边缘聚合，受体与收缩的肌动蛋白丝相互作用产生张力，调节生长锥的型态和细胞骨架的动力使得突起得以生长［10］.
培养条件下I型胶原对神经元突起生长的研究报道尚不多，Carbonetto等［11］认为Ⅰ型胶原对神经突起的生长存在着一定的促进作用，刘松等［12］的动物实验表明胶原能够有助于脊髓前脚运动神经元轴突的再生.从本结果看I型胶原的作用基本介于Ⅳ型胶原和多聚赖氨酸之间，但与LN比有明显差异，说明I型胶原对脊髓细胞突起的生长作用相对较弱.
【参考文献】
［1］ Sanes JR. Extracellular matrix molecules that influence neural development［J］. Annu Rev Neurosci， 1989;12:419516.
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［10］ Reichardt LF. Extracellular matrix molecules and their receptors: Functions in neural development［J］. Ann Rev Neurosci， 1991; 14:531570.
［11］ Carbonetto S， Gruver MM， Turner DC. Nerve fiber growth in culture on fibronectin collagen and glycosaminoglycan substrates［J］. J Neurosci， 1983;3:23242335.
［12］ Liu S， Liu ZH， Said D， Tadie M. Axonal regrowth through collage guidance channel from spinal cord to nerve roots: Experimental study in adult rats［J］. Zhonghua Shenjing Waike Zazhi (Chin J Neurosurg)， 2000；16(5):324326.