作者：唐建兵 陈璧 汤朝武 胡大海
【关键词】 ，毛囊
【Abstract】 AIM: To investigate the regenerative conditions for hair follicle transected and to explore the location of hair follicle stem cells. METHODS： Hair follicle regeneration was observed by culturing the hair follicles transected at different sites (hair bulb， lower 1/3 part and 1/2 part). RESULTS： A new hair bulblike structure formed when hair follicles were transected at the hair bulb or the lower 1/3 extremity. The hair follicles continued to grow， the average growth length of the upper part of them was 078 mm and 067 mm and the growth rates were 75% and 70%， respectively. But only 125% of the hair follicles continued to grow when they were transected at their lower halves， which showed a significantly low growth rate compared with that of the other 2 groups（P&< 001）. CONCLUSION： Hair follicles can regrow and a new hair bulb can regenerate when they are transected at a certain site. The hair follicle stem cells are located in their upper portion of the hair follicles.
【Keywords】persons; hair follicle;tissue culture;stem cells;regeneration
【摘 要】目的: 研究毛囊横断后再生的条件，探索毛囊干细胞的初步定位. 方法： 将人头皮分离成游离的毛囊，共进行了8批横断毛囊培养，每批培养毛囊约30根，每批分3组，从不同位置（紧贴毛球、毛囊下1/3处、毛囊下1/2处）横断毛囊后进行培养，观测毛囊的生长情况及形态学改变. 结果: 紧贴毛球上方或在毛囊下1/3横断，上段毛囊大部分可以再生出新毛球样结构，毛囊可继续生长，上段毛囊平均生长长度分别为078 mm和067 mm，可生长比例分别为75%和70%；在毛囊下1/2横断，上段毛囊可生长比例仅为125%，明显低于前两组（P&<001）. 结论: 在一定位置横断毛囊，上段的毛囊细胞可以发生增殖分化，毛囊可以继续生长，并再生出新的毛球样结构，表明上段毛囊是其干细胞所在地.
【关键词】 人; 毛囊; 组织培养; 干细胞; 再生
0 引言
毛囊作为一个微型器官，它由毛球、毛乳头、毛根、上皮性根鞘和真皮鞘等部分组成.毛囊的生长有赖于上皮与真皮成分间的信息传递［１］，一般认为毛球是毛发生长的基础和毛囊干细胞所在地，但在皮肤移植过程中部分横断的毛囊可以再生出新毛发.最近研究认为毛囊干细胞定位于隆突部，为解释该现象提供了依据［２］.我们通过毛囊的体外培养模型［３］，观察毛囊横断后在体外的再生情况，以验证干细胞的定位.
1 材料和方法
1.1 材料 Williams E培养基购于Gibco公司， 谷氨酰胺购于华美公司， 胰岛素为徐州邦联制药厂产品，转铁蛋白购于北京北方同正公司，亚硒酸钠由第四军医大学军卫教研室提供. Williams E培养基：Williams E 108 g・L-1，谷氨酰胺2 mmol・L-1， 氢化可的松0.4 mg・L-1，胰岛素10 mg・L-1，转铁蛋白10 mg・L-1，亚硒酸钠10 μg・L-1 、庆大霉素40×105 U・L-1.
1.2 方法 从手术室取回去皱术及头皮疤痕扩张器Ⅱ期术后的头皮标本，用盐水清洗血污并去除外露的毛干及部分结缔组织（注意勿伤及毛球），再用25 mg・L-1洗必泰溶液浸泡标本消毒6~8 min，将头皮剪成细条状，在超净台内分离成游离毛囊，置于无血清培养基中.选取结构完整的毛囊分别紧贴毛球上方或在毛囊下1/3或下1/2（以毛根为全长估算）横断，将上段和下段分别转移至96孔板内，每孔1根，再加培养基02 mL，置于37℃ 50 mL・L-1CO2，一定湿度的培养箱中培养.我们共进行了8批横断毛囊培养，每批培养毛囊约30根，每批分3组，分别在紧贴毛球处、毛囊下1/3处、毛囊下1/2处横断，各组观察毛囊数共计均为80，分别比较毛囊上段和下段的生长情况，标本来源于8~36岁不同年龄的男女患者.在倒置显微镜下观察毛囊再生情况（重点为毛球部）：每天在装有目镜测微尺的倒置显微镜下观察横断毛囊的形态学变化并测量横断毛囊的长度，计算出上下段毛囊的最终生长长度和生长比例.
统计学处理：采用SPSS软件进行数据分析，毛囊平均生长长度用x±s表示，采用方差分析进行比较，可生长比例采用χ2检验.毛囊的病理切片HE染色结果比较：选择倒置显微镜下再生出毛球样结构的毛囊，当停止生长后取出毛囊按照钟白玉等［４］报道的方法先将毛囊用琼脂预包埋后作石蜡切片行HE染色.
2 结果
2.1 倒置显微镜观察 紧贴毛球处横断毛囊培养1 d即可见横断处有圆形细胞游出（Fig 1A），培养4 d可见圆形的毛球样结构开始形成(Fig 1B)，培养8 d新毛球基本形成（Fig 1C），上段毛囊可继续向上生长，但生长速度低于完整毛囊培养的生长速度，下段毛球均未能生长；从毛囊下1/3处横断毛囊可见上段毛囊的断端逐渐由根鞘组织包绕，上段毛囊和下段毛囊均可向上延伸，但生长速度均低于完整毛囊；而从毛囊下1/2处横断的毛囊上段大部分不能继续生长，可生长比例明显低于前两组（P&<001），其断端无明显变化，而下段可继续生长，下段生长速度接近完整毛囊生长速度（Fig 2）.实验8个批次间比较无统计学差异，不同位置横断毛囊后毛囊上段和下段的生长速度如Tab 1所示.
Tab 1 Growth of hair follicles dissected on different positions（略）
A: Cells from the hair follicle bulb 1 d ×100； B: A new hair bulblike structure 4 d ×40； C: A new hair bulb 8 d ×40.
图1 从毛球处横断后培养上段毛囊（略）
Fig 1 Cultured upper part of hair follicle transected at hair bulb （略）
图2 从毛囊下1/2处横断毛囊下段生长速度接近完整毛囊生长速度（略）
Fig 2 Growth length of lower part hair follicle dissected on middle position was near to that of the whole hair follicle ×40（略）
图3 毛囊横断后再生出的毛球样结构病理切片HE染色（略）
Fig 3 New hair bulb regenerated after transection of hair follicles HE ×100（略）
2.2 横断毛囊再生后HE染色 光镜下可以看到新生毛球样结构至少由两部分组成，其外面部分呈淡紫色，结构上由外根鞘延续而来，外层细胞致密，体积小，核为卵圆形，内层细胞体积大，核为圆形，部分核已空泡化，内部为嗜伊红结缔组织，类似于毛乳头，里面散在少量成纤维样细胞，核为圆形（Fig 3）.
3 讨论
毛囊干细胞的发现对于毛发的再生和烧伤创面的完全修复具有重要意义［５］.以往认为毛囊的干细胞位于毛球部，毛球是毛囊生长的基础，隆突激活假说认为毛囊的隆突部是毛囊干细胞所在，该假说能更好地解释毛囊的周期性生长，1998年Lyle等［６］进一步认定毛囊干细胞定位于隆突部，并提出毛囊干细胞特异表达的CK15可以作为它的标志.随着细胞培养技术的提高，人们试图分离和培养毛囊干细胞，此举若能实现将可能促使毛发和表皮的原位再生，达到创面的完全修复，因此毛囊干细胞的定位和鉴定更显得重要.
在游离毛囊培养过程中我们发现毛囊中段是最早长出细胞的部位，细胞呈多角形，增殖速度快，而从毛球部长出的细胞为圆形，细胞大且增殖能力极差，说明毛囊中段外根鞘细胞具有高度增殖潜能，毛囊干细胞可能位于此处，又称为隆突区［７］，当它接触到某种外在物质如胶原或受到某种刺激如机械损伤后即开始快速的增殖.我们将从不同部位横断的毛囊按照完整游离毛囊的培养方法进行了培养，结果发现毛球或毛囊下1/3切除后上段毛囊可以再生出新的毛球样结构，而切除毛囊下1/2后上段毛囊几乎不能再生.说明毛囊上段确实存在干细胞群，而毛球不是毛囊再生所必需的因素，毛囊受损后干细胞即开始增殖，并向下迁最终移形成新的毛球结构.但在毛囊1/2处横断后上段毛囊未形成新的毛球结构，可能是由于上段毛囊干细胞群缺失，还可能因为毛囊受损过多后失去了周围的支持因素或信息传导途径.
毛球部包括毛乳头和毛母质区等结构，隆突激活假说认为它是干细胞向分化细胞的过渡区域，即隆突部干细胞分裂若干次后向毛球部迁移，形成毛母质区，这些区域的细胞被称为短暂倍增细胞或短暂扩充细胞［８］(TAc)，然后毛母质的不同部分分化成毛囊的各层结构.毛乳头是毛发生长的重要因素，它调控着毛发的周期性生长.毛囊部分切除后结缔组织鞘或称为真皮鞘细胞则可能衍变成毛乳头细胞，最终形成新的毛球结构.我们从病理切片HE染色结果也可以看出这些新生的毛球结构的确由上述两部分结构组成.
参考文献
［1］ Stenn KS， Paus R. Controls of hair follicle cycling［J］. Physiol Rev， 2001; 81(1):449-494.
［2］ Tang JB， Chen B. The research development of hair follicle stem cells［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao( J Fourth Mil Med Univ)， 2000; 21(Suppl): 119-120.
［3］ Tang JB， Chen B，Tang ChW， Hu DH， Xu MD. Influences of different medium on the human hair follicle culture［Ｊ］. Xibei Guofang Yixue Zazhi (Med J Nat Defence Northwest China)， 2001;22(1): 57-59.
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［5］ Taylor G， Lehrer MS， Jensen PJ， Sun TT， Lavker RM. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis［J］. Cell ， 2000;102(4):451-461.
［6］ Lyle S， ChristofidouSolomidou M， Liu Y， Elder DE， Albelda S， Cotsarelis G. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells［J］. J Cell Sci， 1998; 111 (Pt 21): 3179-3188.
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