【关键词】 烫伤
【Abstract】 AIM: To investigate the distribution and content change of substance P (SP) immunoreactive nerve fibers in the rat spleen post burn and to explore the relation between SP and immunological functions. METHODS: The distribution of SP immunoreactive nerve fibers was observed by the immunohistochemical ABC method combined with glucose oxidaseDABnikel enhancement technique. The rats were inflicted on the back with 20% TBSA of Ⅱ degree scalding by boiling water. The post burn changes in the tissue content of the SP in the spleen were determined by radioimmunoassay (RIA). RESULTS: The rat spleen was richly innervated by positive SP immunoreactive nerve fibers. The tissue content of SP in the spleen decreased significantly (P&<0.01) at 30， 60， 120 and 240 minutes post burn. CONCLUSION: The rat spleen is richly innervated by positive SP immunoreactive nerve fibers and the content of SP in the spleen decreased significantly post burn. SP may play the role of enhancing immunological function.
【Keywords】 substance P; spleen; scalding; immunological function; rat
【摘要】 目的： 研究P物质（substance P， SP）免疫反应阳性神经纤维在大鼠脾脏的分布及烫伤后含量变化，探讨SP与免疫功能的关系. 方法 ： 用ABC免疫组织化学法结合葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺显色技术，观察SP免疫反应阳性纤维在大鼠脾脏的分布；在大鼠背部造成占体表面积20%的深Ⅱ度烫伤，烫伤后不同时间，采用放射免疫分析法测定大鼠脾内SP含量的变化. 结果： 在大鼠脾脏内有较丰富的SP免疫反应阳性神经纤维，多呈串珠状走行于淋巴组织中；与对照组比较，大鼠烫伤后脾脏SP含量［(ng・g-1) 30 min， 13.7±4.3 vs 20.1±3.2， P&<0.05；60 min， 11.8±4.4 vs 18.2±7.5， P&<0.05；120 min， 7.6±2.2 vs 17.1±7.5， P&<0.01; 240 min， 8.1±2.6 vs 16.5±6.4， P&<0.01］明显下降. 结论： 大鼠脾脏内含有较丰富的SP免疫反应阳性神经纤维，烫伤后脾内SP含量明显下降，提示SP可能是导致烧伤后机体免疫功能抑制的因素之一.
【关键词】 P物质；脾脏；烫伤；免疫功能；大鼠
0引言
烧伤作为一种强烈的应激状态可引起神经内分泌系统的变化［1］. P物质（substance P， SP）作为神经肽中速激肽类主要成分之一，是一重要的神经内分泌介质. 胡大海等［2］报道，大鼠烫伤早期垂体前叶SP神经纤维分布范围及数目密度有明显变化. 脾脏是机体重要的免疫器官，脾内是否含有P物质，烧伤后其含量变化以及与机体免疫抑制的关系如何，我们分别应用ABC免疫组织化学法结合葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺显色技术和放射免疫分析法，观察了SP免疫反应阳性纤维在大鼠脾脏的分布以及烫伤后大鼠脾内SP含量变化，并对SP与免疫功能的关系进行了探讨.
1材料和方法
1.1材料正常成年雄性SD大鼠90只（第四军医大学实验动物中心提供），体质量200 ~ 220 g. 取10只用于免疫组织化学形态学研究. 余80只，随机分为8组（n=10)：烫伤大鼠分为30， 60， 120和240 min 4组，对照大鼠对应为30， 60， 120和240 min 4组，分别在烫伤和假烫伤30， 60， 120和240 min断头处死.
1.2方法
1.2.1免疫组化染色实验大鼠在乙醚吸入麻醉下，经升主动脉插管灌流固定. 先以生理盐水快速冲洗，继之灌入40 g・L-1多聚甲醛约400 mL， 取出脾脏，置于同一固定液中后固定6 h，随后浸泡于含200 g・L-1蔗糖的0.1 mol・L-1 PB液中，4℃过夜. 制备30 μm厚的恒冷箱切片，行漂浮法ABC结合葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺显色技术免疫组织化学染色.
染色程序：切片先经3 mL・L-1甲醇双氧水封闭30 min后入10 g・L-1 Triton X100孵育30 min. 然后转入兔抗SP抗体（1∶3000， INC公司），4℃孵育24 h，再依次进入生物素标记的猪抗兔IgG抗血清（1∶500，Dako公司）室温孵育4 h，卵白素生物素复合物（ABC，1∶200，Dako公司）中室温孵育2 h. 然后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺显色液显色20 min. 以上各步骤之间均用10 mmol・L-1磷酸缓冲盐水（PBS， pH 7.4）漂洗3次，每次10 min. 显色结束后，标本经PBS充分漂洗，30 g・L-1中性红复染3 min，继而干燥、脱水、透明、树胶封片. 标本用Olympus Bh3型显微镜观察并摄片. 以正常兔血清替代第一抗体，作为阴性对照.
1.2.2烫伤动物模型的制备烫伤前24 h用0.8 g・L-1的 Na2S背部脱毛，清醒状态下，将大鼠脱毛区置于恒温水浴锅100℃热水内持续16 s，造成占体表面积20%的深Ⅱ度烫伤. 烫伤深度病理证实. 按各组不同的时间间隔作断头处理. 对照组大鼠的处理同上，只是将100℃沸水换成37℃水做假烫伤. 伤后立刻腹腔注射无菌等渗盐水（3 mL/100 g体质量）抗休克，单笼喂养. 创面不予处理.
1.2.3脾脏标本的制备大鼠断头后，立即将脾脏取出，置沸生理盐水中煮5 min，以灭活肽酶. 称质量后，移入含0.1 mol・L-1乙酸1 mL的匀浆管中充分匀浆，在室温搁置2 h再加入0.1 mol ・ L－1的氢氧化钠1 mL. 离心（300 r・min-1， 10 min），取上清液置入－70℃冰箱保存待测.
1.2.4SP含量的放射免疫测定按SP免疫测定试剂盒（北京科荟生物工程应用技术研究所生产）的操作规程采用顺序饱和加样程序进行.
统计学处理：数据用x±s表示，采用SPSS统计学软件进行方差分析.
2结果
经ABC免疫组织化学法结合葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺显色技术染色的大鼠脾脏切片标本内，见有较丰富的SP免疫反应阳性神经纤维分布，呈深蓝色的串珠状或点线状，膨体明显，主要分布于红髓，以脾血窦和小血管周围多见，有的可达血管壁和血窦壁；SP免疫反应阳性神经纤维也见于脾索和边缘区的淋巴组织内，穿行淋巴细胞之间，与淋巴细胞关系密切（Fig1 A， B）. 放射免疫分析法测定大鼠脾内SP含量在烫伤后30 min明显下降仅对照组值的68% (P&<0.05) ；烫伤后60 min和120 min含量继续下降，分别为对照组值的64% (P&<0.05) 和44% (P&<0.01)；烫伤后240 min时SP含量略有回升，但仍显著低于对照组，为对照组值的49% ( P&<0.01， Tab 1 ).
A: fibers around the branches of the arteries×200; B: fibers along the splenic cord and the splenic sinusoid×400.
Fig 1SP immunoreactive nerve fibers in the spleen（略）
表1烫伤大鼠脾内SP含量的变化（略）
Tab 1Change of SP content in spleen of rat after burn（略）
3讨论
SP由11个氨基酸组成，属速激肽家族，为最早发现的神经肽之一，由于其体内分布广泛且与很多重要的生理病理变化密切相关，因而在许多领域受到关注及研究. 脾脏是机体重要的免疫器官，我们用ABC免疫组织化学法结合葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺显色技术和放射免疫测定方法，证实大鼠脾脏有SP免疫活性物质存在. 脾脏淋巴组织中可见SP免疫反应阳性神经纤维，穿行淋巴细胞之间，与淋巴细胞关系密切. 已有人证实免疫细胞存在SP受体［ 3， 4 ］，由此我们推测，穿行于淋巴组织实质内的SP免疫反应阳性神经纤维，很可能是通过其末梢释放SP免疫活性物质，作用于脾内免疫细胞上的SP受体，进而影响免疫功能，这还有待于进一步的研究证实.
烧伤可引起机体免疫功能抑制，尤其是细胞免疫功能抑制更为明显［5］，而持续的细胞免疫功能抑制往往导致致死性败血症. 但造成烧伤后免疫抑制的原因及始动环节，目前仍不十分清楚. 因此，研究烧伤后免疫抑制的机制显得十分必要. 本实验的结果显示，大鼠烧伤后脾内SP含量明显下降，提示可能是导致烧伤后机体免疫功能抑制的因素之一，亦即SP可能有增强机体免疫功能的作用. 这种对免疫功能增强的作用可能表现在多方面：如上述的SP可能通过其受体直接作用于免疫细胞，也可能通过刺激细胞因子、炎性介质或其他信号分子的释放，间接地对免疫功能产生影响［6］. 已有实验证实SP既能促进单核巨嗜细胞的趋化、游走活性和吞噬功能；刺激单核巨嗜细胞氧化爆发反应及释放多种免疫活性因子；促进B淋巴细胞合成免疫球蛋白，亦可增强刀豆素A及植物血凝素所致的人外周血T淋巴细胞的增殖反应，刺激嗜中性粒细胞的趋化运动［7-9］. 这些结果从另一个角度表明了，SP有增强免疫功能的作用. Onuoha等［10］亦认为，SP作为一种神经调质，在烧伤后机体免疫、疼痛、炎症以及创伤恢复中起着重要作用. 至于在烧伤条件下脾内SP含量减低是神经肽的合成下降，还是降解加速所致，尚需进一步研究证明. 本实验结果为阐明神经系统对免疫系统的作用和途径，为进一步探讨烧伤后机体免疫抑制的机制提供了资料.
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