作者：章翔，吴景文，郭衍，付洛安，高大宽
【关键词】 脑胶质瘤
【Abstract】 AIM: To detect the expression of integrinβ1 gene in human gliomas and analyze its clinical significance. METHODS: The expression of integrinβ1 gene in 53 pieces of gliomas was detected by immunohistochemical and hybridization technique in situ. The patients were followed up and their prognosis was compared. RESULTS: The positive rate of Integrinβ1 in gliomas of grade I to Ⅳ was 36.3%， 38.5%， 72.2% and 81.8% respectively. The integrinβ1 positive rate in gliomas of grade Ⅲ and Ⅳ was higher than that of grade I and Ⅱ (P&<0.05). The integrinβ1 mRNA expression in gliomas was positively correlated with its protein expression. Patients with higher expression of integrinβ1 had poorer prognosis and shorter survival time. CONCLUSION: The higher expression of integrinβ1 is closely related with the lower differentiation and higher invasiveness of gliomas. Integrinβ1 may be a good indicator in predicating the prognosis of gliomas patients.
【Keywords】 integrin β1; glioma; immunohistochemistry; hybridization in situ
【摘要】 目的： 检测脑胶质瘤中整合素β1基因表达，阐明其临床意义. 方法： 应用免疫组化和原位杂交法，分析53例人脑胶质瘤整合素β1基因表达，对患者随访并比较其预后. 结果： 整合素β1蛋白阳性率，在I~IV级脑胶质瘤分别为36.3%， 38.5%， 72.2%和81.8%，高级别（Ⅲ~Ⅳ）高于低级别（Ⅰ~Ⅱ）（P＜0.05），其mRNA表达同蛋白表达. 高表达整合素β1的患者预后较差. 结论： 整合素β1的高表达与脑胶质瘤分化程度低、侵袭性强密切相关，是预测患者预后的较好标示物.
【关键词】 整合素β1；脑胶质瘤；免疫组化；原位杂交
0引言
人脑胶质瘤细胞恶性增殖和侵袭生长是其病理特征之一，也是术后肿瘤复发，导致患者预后不良的主要原因. 该过程涉及肿瘤细胞粘附、基质降解、细胞迁移等多环节. 肿瘤侵袭与各种因素有关，如：整合素（integrin）、tenascin及透明质酸等［1-3］，其中细胞粘附分子integrin是肿瘤侵袭生长的步骤之一，它通过与细胞外基质蛋白的相互作用，以及细胞间的粘附和信号传导，促进肿瘤形成、生长、分化和转移［3］. Integrinβ1是粘附分子家族的主要成员，它与脑胶质瘤恶性表型以及患者预后的相互关系，国内尚研究报道甚少，对此，我们采用免疫组化和核酸原位杂交法进行了初步探讨.
1材料和方法
1.1材料① 样本来源人脑胶质瘤石蜡标本取自1995/1996本校西京医院病理科手术标本蜡块，共53例. 标本均经40 g・L-1甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，厚5 μm. 取材患者年龄21 ~74岁，平均(47±11)岁. 胶质瘤分化程度按WHO分级，Ⅰ~Ⅱ级为分化较好，Ⅲ~Ⅳ级为分化不良. Ⅰ级11例，Ⅱ级13例，Ⅲ级18例，Ⅳ级11例. ② 主要试剂和杂交探针 羊抗人integrinβ1 mAb和SABC试剂盒分别为Santa Crux和博士德公司产品. mRNA寡苷核酸探针由北京赛百盛生物公司合成，反义寡核苷酸探针序列为5′GCAGTAAGCATCCATATC3′互补于integrinβ1 mRNA的第1643~1661位点［4］，其相应对照正义寡核苷酸探针序列为3′CGTCATTCGTAGGTATAG5′. 按Boehringer Mannheim公司的地高辛寡核苷酸加尾标记试剂盒操作流程进行.
1.2方法
1.2.1免疫组化按试剂盒说明书，采用SABC法，对4 μm厚系列石蜡切片进行组化染色，检测各级脑胶质瘤标本integrinβ1表达.
1.2.2核酸原位杂交mRNA原位杂交方法和步骤按Boehringer Mannheim公司的地高辛标记和检测试剂盒操作流程进行. 实验中以预杂交液代替杂交液为空白对照；阳性标本重复染色作为阳性对照，杂交前RNase消化并以正义寡核苷酸探针代替反义寡核苷酸探针为阴性对照. 杂交主要步骤：切片脱蜡水化，1×PBS/DEPC 液洗5 min×2次；40 g・L-1多聚甲醛，1×PBS后固定. 依次入pH 7.2，1×PBS溶液、0.1 mol・L-1甘氨酸＋1×PBS溶液， 4 g・L-1 Triton X100＋1×PBS溶液漂洗. 经50 mg・L-1蛋白酶K在37℃下孵育30 min后，入4 g・L-1多聚甲醛＋1×PBS 溶液5 min，以1×PBS洗片后，浸入25 g・L-1乙酸酐10 min，2×SSC 10 min，然后将切片移入杂交液. 杂交液内探针浓度为50 mg・L-1，42℃，振荡杂交16 h. 切片经梯度SSC和2×PBS漂洗后，加AP标记的抗Dig抗体Fab片段(浓度1∶800)，37℃， 40 min，室温1 h，分别用TSM1液和TSM2液漂洗，滴加NBT/BCIP湿盒中避光显色4～6 h，TE缓冲液终止显色，1×PBS洗5 min，中性红复染，脱水透明，中性树胶封片.
统计学处理：数据以百分率（%）表示，采用χ2检验.
2结果
2.1Integrinβ1的表达及分布Integrinβ1阳性染色为棕黄色颗粒，分布于胶质瘤细胞膜和细胞质. 结果判断为随机选择的5个高倍视野（×400），阳性细胞数≥5个，即为β1染色阳性. 阳性程度分级为(-)为无棕黄色颗粒，(+)为阳性细胞数占总数≤10%，()为阳性细胞数占总数11%～50%，()为阳性细胞占总数50%以上（Fig 1）. 统计分析表明（χ2检验），Ⅲ~Ⅳ级脑胶质瘤阳性率明显高于Ⅰ~Ⅱ级脑胶质瘤(P&<0.05），Ⅰ， Ⅱ级间和Ⅲ， Ⅳ级间的integrinβ1阳性率比较差异不显著（P&>0.05， Tab 1）.
表1Integrinβ1在胶质瘤中的蛋白表达（略）
Tab 1Expression of integrinβ1 protein in glioma（略）
2.2Integrinβ1核酸原位杂交核酸原位杂交阳性表现为紫蓝色颗粒，结果显示integrinβ1 mRNA主要分布于肿瘤细胞质中，小部分位于胞核内. 显微镜高倍视野(×400)下计数杂交阳性肿瘤细胞. 标准为：(-)细胞质不着色；(+)细胞质有细小、稀疏、紫蓝色颗粒；()细胞质较密的细小、紫蓝色颗粒；()细胞质明显致密的紫蓝色颗粒（Fig 2）. 统计分析表明，Ⅲ~Ⅳ级脑胶质瘤integrinβ1 mRNA杂交阳性率明显高于Ⅰ~Ⅱ级脑胶质瘤(P&<0.05)，Ⅰ， Ⅱ级间和Ⅲ， Ⅳ级间的integrinβ1 mRNA阳性率比较差异不显著（P&>0.05， Tab 2）.
图1Integrinβ1在胶质瘤中的蛋白表达（略）
Fig 1Expression of integrinβ1 protein in glioma (grade ) SABC×400（略）
图2Integrinβ1在胶质瘤中的mRNA表达（略）
Fig 2Expression of integrinβ1 mRNA in glioma (grade Ⅲ) NBT/BCIP×400（略）
表2Integrinβ1 mRNA在各级胶质瘤中的表达（略）
2.3integrinβ1 表达与患者预后对53例标本中46例患者的目前生存情况进行了随访，其中integrinβ1 表达为－， ＋，，患者的生存率分别为78.5%， 52.4%， 9.12%和0%. 统计学分析表明（χ2检验），integrinβ1表达阳性率越低，生存率就越高，反之亦然；integrinβ1 表达为－，＋患者的生存率显著高于integrinβ1 表达为~的患者生存率（P&<0.05）.
3讨论
Integrin是一类由α， β两个亚基组成的跨膜糖蛋白，介导细胞与细胞基质、细胞与细胞间的粘附. 研究表明，integrin与肿瘤的恶性表型，如无限制性生长、低分化和侵袭转移等密切相关，其恶性表型决定了肿瘤患者临床病情的进程. 肿瘤浸润、转移与integrin分子表达和分布密切相关，胶质瘤细胞表达integrin分子具有不一致性，这可能与integrin分子的不同作用和胶质瘤细胞的高度异质性有一定相关性. Paulus 等［5］研究发现，integrinβ1 在正常脑组织有少量表达，integrinα3和β1在恶性胶质瘤组织中表达较高. Integrinβ1能与多种α亚基相结合，如integrinα2β1， α3β1， α5β1 和α6β1等，它们是细胞外基质胶原蛋白，纤维连接蛋白和层粘连蛋白的受体，共同参与胶质瘤的侵袭生长过程［6-8］. 抗integrinα2β1， α3β1， α5β1及α6β1抗体可使C6胶质瘤细胞体外移行能力减弱；经诱导过表达integrinβ1的C6胶质瘤细胞裸鼠皮下致瘤性增强；integrinα3β1， α6β1与LN的结合，促进了U251， A172和T98G胶质瘤细胞的侵袭性；抗integrinβ1抗体可明显抑制胶原蛋白I和IV的促U138和U373MG胶质瘤细胞的粘附和侵袭作用，这说明integrinβ1与胶质瘤的侵袭生长密切相关［9，10］.
我们的研究发现，分化良好的脑胶质瘤组织integrinβ1阳性率明显低于分化不良者，这与国外的有关研究结果相一致；且integrinβ1的高表达与脑胶质瘤组织分化程度低、高度粘附和侵袭生长等恶性表型密切相关，并可能对其恶性表型起正性调节作用；integrinβ1表达阳性率越高的患者，其预后越差. 本实验结果提示，integrinβ1表达是胶质瘤恶性表型的具体表现，因此可作为患者预后评估的重要指标.
参考文献
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