作者：高军宪，万琪，田晔，李力，刘勇红
【关键词】 ，钙离子
【Abstract】 AIM: To study the changes of intracellular ［Ca2+］ and cell activity in cortical neurons following ischemiclike conditioning and to explore the protective effects of dantrolene on the neurons. METHODS: Neurons were cultured and loaded with Flu3/AM， ［Ca2+］i was measured by fluorescent intensity (FI) in each cell with confocal microscopy and the degree of injured neurons was analyzed with MTT reduction assay. RESULTS: After 10 min ischemiclike conditioning， a rapid increase in fluorescence intensity was observed. There was no difference between ischemic group and therapy group (P&>0.05). The A value of injured neurons in ischemic group was significantly lower than that in therapy group. CONCLUSION: Dantrolene inhibits the increase of ［Ca2+］i in cortical neurons and alleviates the degree of the injured neurons following ischemiclike conditioning.
【Keyword】 calcium; ischemiclike; dantrolene
【摘要】 目的： 观察类缺血后神经元内钙离子浓度及细胞活性的变化，探讨缺血性神经元的损伤与细胞内钙离子的关系及丹曲林钠（Dantrolene）的作用. 方法： 采用孕小鼠皮层神经元培养技术，应用相差显微镜观察培养的神经元形态，激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内钙离子浓度. 结果： 给予神经元类缺血处理5 min后，神经元内钙离子浓度与丹曲林钠组无显著差异(P&>0.05). 类缺血处理10 min后再灌注15 min细胞损伤程度较丹曲林钠干预组［Ca2+］i和MTT有显著性差异(P&<0.01). 结论： 丹曲林钠可抑制神经元细胞内钙离子浓度的升高，降低缺血性神经元损伤的程度.
【关键词】 钙离子；类缺血；丹曲林钠
0引言
神经元对缺血、缺氧十分敏感，即使时间很短也会造成不可逆损伤，而这种损伤机制非常复杂，至今尚未阐明，但损伤后细胞内钙离子浓度升高是细胞损伤的重要原因， 细胞Ca2+信号转导异常被认为是神经细胞死亡的“最后共同通道”. 我们采用Flu3/AM为钙离子指示剂，参照Mitani等［1］法建立类缺血模型，采用激光扫描共聚焦技术［2］，监测缺血期间钙离子的变化并采用MTT比色试验观察缺血神经元的损伤情况，观察丹曲林钠（Dantrolene）的作用.
1材料和方法
1.1材料① 动物：孕15 d昆明种二级孕鼠(体质量100 g)由第四军医大学实验动物中心提供（陕动字003号）.② 主要试剂和仪器：胎牛血清由杭州四季青公司提供，DMEM由Gibco公司提供，胰酶由华美公司提供. CO2培养箱由Sanyo公司提供.
1.2方法
1.2.1激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿的处理在直径60 mm塑料培养皿中央钻一直径10 mm的圆孔，将18 mm×18 mm盖玻片用加拿大胶粘于孔底部，消毒后使用.
1.2.2配制人工脑脊液其组成为（mmol・L-1）：NaCl 123， KCl 3.75， Kh3PO4 1.25， NaHCO3 26， MgCl2 1， CaCl2 2， 葡萄糖10，pH=7.4.
1.2.3细胞培养取孕15 d昆明种二级孕鼠，引臼脱颈处死，碘酒乙醇消毒腹部，逐层剖开腹部，取出胎鼠，仔细剥离胎膜羊膜，暴露胎鼠，体视显微镜下剥离脑膜，分离胎鼠大脑脑泡外侧部的皮质，剪碎脑组织，经1.25 g・L-1的胰酶消化(37℃， 25 min)，静置2~3 min 弃上清，200 g・L-1胎牛血清的DMEM终止消化5~8 min，以完全培养基(100 mL・L-1胎牛血清，青、链霉素1×1011 U・L-1)稀释至7×108・L-1密度并接种于经多聚赖氨酸(Sigma )处理过的专用培养皿和96孔板(细胞接种1×105/孔)，送入含50 mL・L-1 CO2和950 mL・L-1 O2的培养箱(Sanyo公司)， 37℃，培养48 h后，加入阿糖胞苷(5 mg・L-1)以抑制非神经元的继续生长，每隔2 d半量换液，培养10 d后，可见典型的神经元细胞，经βtubulin免疫荧光染色显示80%以上细胞为阳性，可认为是纯神经元培养［3］.
1.2.4类缺血模型建立细胞培养基换为不含糖的人工脑脊液ngACSF，温度保持在(30±2)℃，混合气体换为920 mL・L-1 N2/80 mL・L-1 CO2.
1.2.5实验分组缺血组(对照组)：按类缺血模型处理5和10 min. 实验组：给予30 μmol・L-1丹曲林钠（Sigma公司）孵育10~15 min后，类缺血处理5和10 min. 同时对照组及实验组均分为有钙ngACSF和无钙ngACSF 2组. 每组取n=8个细胞测其△FI作为观察结果.
1.2.6神经元细胞［Ca2+］i的浓度测定将培养皿内培养的细胞经磷酸缓冲液（PBS）冲洗3次，于37℃条件下用Fluo3/Am(终浓度10 μmol・L-1， BioRad公司)负载30 min， PBS冲洗3次，将培养皿置于ACAS570载物台上，在激光共聚焦显微镜下动态扫描细胞内荧光强度变化（Fig 1），激发波长488 nm， 发射波长522 nm，采样频率为488 Hz，共聚焦系统由BioRad公司MRC1024提供的TimeCourse/Ratiometric软件控制，每皿选2~3个视野，以平均荧光强度变化（FI）反映胞内游离钙离子浓度的相对水平［4］.
1.2.7MTT测定向96孔板每孔加入MTT（华美公司，1.5 g・L-1） 20 μL， 37℃继续培养4 h， 吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪测各孔A490 nm值.
统计学处理：数据经Pentrium90微机系统TimeCourse/Ratiometric软件对图形及时间进行实时测量获得.采用Origin 6.0统计软件进行数据处理，以x±s表示，组间比较采用方差分析.
2结果
2.1丹曲林钠对早期类缺血后神经元［Ca2+］i的影响ngACSF条件下皮质神经元经丹曲林钠干预后的给予类缺血处理5 min后［Ca2+］i (3.86±0.01)上升与ngACSF对照组(4.02±0.06)无显著性差异(P&>0.05). 无钙ngACSF条件下皮质神经元经丹曲林钠干预后的给予类缺血处理5 min后［Ca2+］i (2.09±0.01)上升与无钙ngACSF对照组 (2.10±0.02)也无显著性差异（P&>0.05）.
2.2丹曲林钠对类缺血再灌注后神经元［Ca2+］i的影响类缺血10 min丹曲林钠处理过的ngACSF的神经元给予类缺血处理后［Ca2+］i上升与ngACSF对照组有显著性降低. 而经丹曲林钠处理过的无钙ngACSF组的［Ca2+］i的升高也较对照组的上升幅度显著性降低（Tab 1）.
图1神经元类缺血10 min后 ［Ca2+］i（略）
Fig 1Intracellular ［Ca2+］ in cultured cortical neurons after 10 min ischemiclike conditioning (略)
表1丹曲林钠对类缺血10 min后神经元内△FI的作用（略）
Tab 1Effects of dantrolene on the △FI after 10 min ischemiclike condition(略)
2.3MTT法观察丹曲林钠对类缺血处理神经元活性的影响类缺血10 min再灌注4 h MTT测细胞活性实验组(加用丹曲林钠)A490 nm值(0.278±0.032)与缺血对照组A值（0.200±0.021）相比显著性升高(P&<0.01).
目前认为在神经元细胞膜不仅有两种引起细胞内Ca2+升高的钙通道，同时神经元还拥有在细胞兴奋时释放Ca2+的胞内钙池，例如内质网等. 当神经元在含钙ngACSF中类缺血后5 min可见［Ca2+］i的明显升高，但丹曲林钠对此［Ca2+］i无显著性减低作用. 说明含钙脑脊液中 ［Ca2+］i在类缺血早期的上升主要来自于胞外的钙内流，胞内的钙释放并未起主要的作用. 而在类缺血10 min时丹曲林钠对含钙和无钙ngACSF中的神经元［Ca2+］i均有抑制作用，这一点与尼卡地平和MK801有很大的不同，因为后两者只作用于胞膜的钙通道，而丹曲林钠作用于胞内钙池. 在无钙脑脊液中观察到的［Ca2+］i主要是由于胞内钙池的钙释放［5］. 因此，在类缺血10 min引起的［Ca2+］i升高，不但有胞外的钙内流，也有胞内钙池的钙释放. 这些结果提示缺血后神经元内 ［Ca2+］i的升高不但有细胞外的钙离子内流，细胞内钙池的钙离子释放也起一定的作用. 而胞内钙释放一部分钙离子来自于Ca2+敏感的Ca2+释放通道（CICR）机制.
在类缺血早期丹曲林钠对［Ca2+］i升高无明显作用，而随着类缺血10 min后丹曲林钠对神经元［Ca2+］i均有明显的下降，说明随着缺血时间的进一步延长胞内钙池均参与了［Ca2+］i的升高. 而这种迟后的钙离子内流被认为是神经元损伤特别是海马神经元损伤的最主要原因［4］. 这点通过对类缺血后神经元的活性检测进一步证实，丹曲林钠有一定的神经元保护作用.
调控内质网内外Ca2+浓度的也有两种钙释放通道，三磷酸肌醇受体（IP3R）和 RyR. 它们均可使细胞内Ca2+浓度升高. IP3R在细胞内钙离子浓度为200 nmol・L-1时最佳开放浓度，低于或高于此值时活性明显降低，而RyR在1~100 μmol・L-1之间都可使RyR开放. IP3R的最佳开放浓度与正常细胞的［Ca2+］i接近［6］，因此在神经元缺血中胞内钙池的钙离子释放可能以RyR为主. 丹曲林钠，作为一种胞内钙池钙离子释放的阻滞剂对损伤神经元的保护作用在离体的脑片上已有报道［1，4，7］. 同时在癫痫的反复强直阵挛发作引起的神经元缺血损伤也有保护作用［8］. Nozaki等［9］利用结扎蒙古沙土鼠右颈总动脉作脑缺血模型发现虽然在脑缺血后6 h RyR的免疫反应性（通过RyR抗体）与对照组无任何明显差异. 提示在脑缺血后6 h RyR的蛋白结构并未完全破坏. 但在海马CA1 ［3H］ryanodine 显著减少，提示:［3H］ ryanodine 在海马CA1区减少可能是由于此区Ca2+释放通道功能紊乱，而这种紊乱可能与导致海马CA1区易损有密切的关系［9］. 而这些均提示RyR在脑缺血中具有一定的作用. 有研究表明RyR在哺乳动物的大脑可表达3种异构体即RyR1， RyR2和RyR3，虽然在大脑的不同部位分布有差别，但同一部位至少有一种RyR亚型［10］. 这说明RyR在脑缺血后功能的变化具有普遍意义. 本实验证实缺血后神经元内［Ca2+］i的升高早期主要来自细胞外的钙离子内流，随着时间延长细胞内钙池的钙离子释放也起一定的作用. 而胞内钙释放钙离子则主要来自于CICR机制. 同时丹曲林钠作为阻滞缺血神经元内钙池释放钙离子对缺血神经元的损伤有一定的保护作用［5，8］.
参考文献
［1］ Mitani A， Yanase H， Sakai K. Origin of intracellular Ca2+ elevation induced by in vitro ischemiclike condition in hippocampal slices ［J］. Brain Res， 1993; 601: 103-110.
［2］ Menahem.S， David M.Confocal micropic imaging of ［Ca2+］i in cultured rat hippocampal neurons following exposure to NmethylDAsprtate ［J］. J Physiol， 1992;448:655-676.
［3］ Liou YH， Wan Qi， Zhang W， Li L， Wang HD. Effects of nicardipine on intracellular Ca2+ and cell activity in cultured cortical neurons after ischemiclike conditioning ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)， 2002;23(6):521-523.
［4］ Yano T， Nakayama R， Imaizumi T， Terasaki H， Ushijima K. Dantrolene ameliorates delayed cell death and concomitant DNA fragmentation in the rat hippocampal CA1 neurons subjected to mild ischemia ［J］. Resuscitation， 2001;50(1):117-125.
［5］ Gao JX， Wan Qi. The effects of nicardipine on intracellular Ca2+ and cell activity in cultured cortical neurons after ischemiclike conditioning ［J］. Zhongguo Linchuang Kangfu (Chin J Clin Rehabili)， 2002;6(8):1120-1121.
［6］ Bezprozvanny I， Watras J， Ehrlich BE. Bellshaped calcium response curves of Ins(1， 4， 5) P3 and calciumgated channels from endoplasmic reticulum of celebellum ［J］. Nature， 1991;351:751-754.
［7］ Wang C， Nguyen HN， Maguire JL， Perry DC. Role of intracellular calcium stores in cell death from oxygenglucosen deprivation in a neuronal cell line ［J］. J Cereb Blood Flow Metab， 2002;22(2):206-214.
［8］ Pelletier MR， Wadia JS， Mills LR， Carlen PL. Seizure induced cell death produced by repeated titanic stimulation in vitro: Possible role of endoplasmic reticulum calcium stores ［J］. J Neurophysiol， 1999;81:3054-3064.
［9］ Nozaki H， Tanaka K， Gomi S， Mihara B， Nogawa S， Nagata E， Kondo T， Fukuuchi Y. Role of the ryanodine receptor in ischemic brain damagelocalized reduction of ryanodine receptor binding during iachemia in hippcampus CA1 ［J］ . Cell Mol Neurobiol， 1999; 19(1):119-131.
［10］ Giuseppe G， Gnti A， Mammarella S， Scrobogne M， Sorrentino V. The ryanodine receptor/calcium channel genes are widely and differentially in murine brain and peripheral tissues ［J］. J Cell Biol，1995;28:893-903.