作者：佟建秋，王禾，沈瑞雄，石炳毅，莫春柏，周文强
【关键词】 皮肤移植
【Abstract】 AIM: To investigate the survival time of skin allograft in recipient rat by orally feeding donors spleen cells and to study the mechanism of oral tolerance. METHODS：The inbred SD rats were chosen as skin donors and inbred Wistar rats as recipients， and heterotopic skin transplantations were performed. The 20 recipients were classified into 2 groups randomly. In group A (control group) heterotopic skin transplantations were performed and in group B (feeding group) heterotopic skin transplantations were performed following a 7day feeding of 5×107 (daily) donor splenocytes by means of gastric intubation. The mixed lymphocyte culture in vitro and delayedtype hypersensitivity(DTH) response in vivo were examined and the survival time of skin allograft was observed. RESULTS： Lymphocytes from Wistar rats that were prefed with allogenetic SD rats splenocytes exhibited a significant reduction of mixed lymphocyte response in vitro and delayedtype hypersensitivity response in vivo， compared with the unfed controls. While the unfed controls rejected the skin allografts within (4.9±0.1) days， the prefeds skin allograft survival time was (158±13) days.(P&<0.01， n = 10). CONCLUSION： Orally administered alloantigen can downregulate the immune response to histocompatibility antigens， thus prolonging the survival time of skin allograft.
【Keywords】oral antigen；skin transplantation；lymphocyte culture test， mixed；hypersensitivity， delayed
【摘 要】 目的： 观测口服供者脾细胞后受者大鼠皮肤移植物的存活时间，并探讨口服耐受的形成机制.方法： 以纯系SD大鼠为供者，纯系Wistar大鼠为受者，行异体皮肤移植，将20只受者大鼠随机分成2组：A组为对照组，单纯作皮肤移植；B组为口服抗原组，本组于皮肤移植前7 d始每日接受供者脾细胞5×107个，导管灌胃，7 d后观察体外混合淋巴细胞培养(MLC)、体内的迟发型超敏反应（DTH），并行皮肤移植，观察移植皮肤的存活时间.结果： 口服抗原后，体外混合淋巴细胞培养及体内的DTH反应均出现明显的抗原反应性降低，口服抗原组的移植皮肤存活时间达到(158±13) d，而对照组为(49±01) d，两组差异显著（P&<001，n=10）.结论： 口服抗原可以引起受者对异基因抗原的特异性免疫反应降低，能使受者的皮肤移植物存活期延长.
【关键词】 口服抗原；皮肤移植；淋巴细胞培养试验；超敏反应，迟发型
0 引言
器官移植是某些终末期疾病的唯一治疗手段，虽然免疫抑制剂的应用使急性排斥得到了比较满意的解决，但它有难以避免的副作用，长期大量使用将致肝肾功能损害、免疫功能受损，而且也不可能完全避免排斥，这已成为进一步提高病人远期存活的巨大障碍，既能使移植物长期存活，又不损害宿主免疫功能的理想方法之一是诱导宿主对移植器官的特异免疫耐受.本实验采用供体SD大鼠脾细胞经过口服途径注入到受体Wistar大鼠的胃内，7 d后观察体外混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture，MLC)及体内迟发型超敏反应(delayedtype hypersensitivity，DTH)，并行供受体间的皮肤移植，观察皮肤存活时间，探讨口服途径对机体免疫耐受诱导的效果.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性纯系Wistar大鼠、SD大鼠、DA大鼠，所用品系为8~10 wk龄，体质量（120±10） g，中国国家啮齿类试验动物中心提供.SD大鼠为供者，Wistar大鼠为受者，行皮肤移植，将20只受者大鼠随机分成2组：A组为对照组，单纯作皮肤移植；B组为口服抗原组，即每日口服供者SD大鼠脾细胞5×107个，7 d后行皮肤移植.
1．2 方法
1．2．1 脾细胞的制备与喂养 麻醉剖腹取出SD大鼠的新鲜脾脏，用剪刀剔除结缔组织和脂肪并剪碎脾脏，将脾组织置于平皿内的100目不锈钢丝网内研碎，用Hanks液收集，将细胞悬液再通过200目不锈钢丝网后，离心（2000 r・min-1，10 min），除去上清液后低渗处理去除红细胞，再次离心洗涤，重悬细胞，作细胞计数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度至5×107 ・mL-1，然后用球头注射器抽取1 mL注入到Wistar大鼠胃内.
1．2．2 单向混合淋巴细胞培养 ① 外周血单个核细胞的分离及反应细胞的制备：口服抗原后7 d，分别取SD大鼠、DA大鼠、Wistar大鼠（包括对照组与口服抗原组）的抗凝静脉血3 mL，用淋巴细胞分层液密度梯度离心分离外周血单个核细胞，用RPMI1640液洗3次，每次1000 r・min-1，离心10 min，计数，然后用完全的RPMI1640培养液调整细胞浓度至1×106・mL-1.将调整好的Wistar大鼠（包括对照组与口服抗原组）的外周血单个核细胞作为反应细胞.② 刺激细胞的制备：取调整好细胞浓度为1×106・mL-1的SD大鼠及DA大鼠的淋巴细胞加入丝裂霉素，最终浓度为25 ng・mL，于37℃水浴中作用30 min，1000 r・min-1，离心10 min，弃上清，沉淀细胞用Hanks液洗涤3次.③ 混合淋巴细胞培养（MLC）：将反应细胞和刺激细胞各100 μL，加入96孔平底板中，每组7个复孔，共分四组，并设反应细胞、刺激细胞等作为对照组细胞.MLC 1组：未口服供者脾细胞的Wistar大鼠和SD大鼠的外周单个核细胞；MLC 2组：未口服供者脾细胞的Wistar大鼠和无关第三者DA大鼠的外周单个核细胞；MLC 3组：口服供者SD大鼠脾细胞的Wistar大鼠和SD大鼠的外周单个核细胞；MLC 4组：口服供者SD大鼠脾细胞的Wistar大鼠和无关第三者DA大鼠的外周单个核细胞.37℃，50 m L・ L-1CO2培养箱中培养72 h，终止培养前6 h加入MTT10 μL，继续培养6 h，用酶标光度计以波长为570 nm，参考波长为630 nm，分别测量A值.
1．2．3 迟发型超敏反应（DTH） 取Wistar大鼠40只，随机分为4组，每组10只. 口服抗原后7 d，取口服抗原组和未服抗原组的Wistar大鼠，于腹股沟sc 1×107（50 μL）个供体SD大鼠脾细胞.7 d后，分别在各组Wistar大鼠左侧后脚掌注射50 μL 1640液；右侧后脚掌分别注射1×107（50 μL）个SD，DA大鼠脾细胞，根据不同Wistar大鼠右侧后脚掌注射脾细胞的差异分为：DTH 1组，未服抗原的Wistar大鼠注射SD大鼠脾细胞；DTH 2组，未服抗原的Wistar大鼠注射DA大鼠脾细胞，DTH 3组，口服SD大鼠脾细胞Wistar大鼠注射SD大鼠脾细胞；DTH 4组，口服SD大鼠脾细胞的Wistar大鼠注射DA大鼠脾细胞.24 h后，用游标卡尺测量两个脚掌的厚度，取二者之差为DTH指标.
1．2．4 同种异体皮肤移植 Wistar大鼠为受者，SD大鼠为供者，同种异体皮肤移植.① 10 g・L-1异戊巴比妥钠 ip麻醉供者和受者；② 皮肤取自供者SD大鼠腹部，面积为15 cm×15 cm，移植于受者Wistar大鼠的双侧季肋部，严密包扎，石膏固定.
1．2．5 皮肤存活时间的观察 皮肤移植后，每天观察皮肤移植物局部情况，以皮片完全干缩或结痂作为排斥的标准.
统计学处理：实验数据用x±s表示，组间比较应用方差分析.
2 结果
2．1 口服抗原后受者大鼠对供者的单向混合淋巴细胞培养 口服供者SD大鼠脾细胞后7 d，Wistar大鼠对供者SD大鼠的单向混合淋巴细胞增殖反应明显降低，即MLC3与MLC1相比，如Fig 1所示（平均降低71%，P&<001，n=7），而口服抗原组对于无关第三者DA大鼠的外周单个核细胞的混合淋巴细胞增殖反应仅稍有降低，即MLC2与MLC4相比，降低无显著差异.
bP&<001 vs MLC3.
图1 混合淋巴细胞培养 （略）
Fig 1 Mixed lymphocyte culture（略）
2．2 迟发型超敏反应 口服抗原后7 d，检查Wistar大鼠对SD及DA大鼠的DTH反应，口服抗原组DTH3的Wistar大鼠对供者SD大鼠的DTH反应仍在较低水平，其两脚掌厚度差为（0100±0027） cm，与对照组DTH1（0183±0018） cm相比差异显著（平均降低45%，P&<001，n=10），而对无关第三者DA大鼠的DTH反应，口服组DTH4（0118±0009） cm与对照组DTh3（0125±0008） cm相比差异无显著性（Fig 2）.
2．3 皮肤移植物存活时间 A组皮肤移植后3~4 d开始脱水干燥，增厚变硬，色深红，部分区域点状发黑，6 d后完全干缩坏死，发生急性排斥的平均时间为（49±01） d；B组移植后第4日皮色红润，有弹性，薄而软，12~14 d后部分区域脱水，色深红，皮稍厚变硬，16~18 d以后坏死脱落.发生排斥反应的平均时间为（158±13） d.
图2 迟发型超敏反应（略）
Fig 2 Delayedtype hypersensitivity response（略）
3 讨论
到目前为止，诱导和维持免疫耐受的方法很多，如特异性全血输注［1，2］、脾细胞输注［3］或骨髓细胞输注［4］、胸腺内抗原输注［5］等方法，胡军等［6］曾利用胸腺、骨髓细胞联合移植的方法有效延长异种皮肤移植存活.而口服途径诱导免疫耐受作为一种独特的方法近年来也被人们重视和关注，应用口服抗原治疗自身免疫性疾病已经在许多动物模型上获得了成功，如口服髓鞘蛋白治疗脑脊髓炎［7］；口服胶原蛋白治疗大鼠佐剂性关节炎［8］等；口服S抗原治疗葡萄膜视网膜炎［9］等.尽管口服抗原在自身免疫性疾病的治疗中可以产生特异性免疫无反应性，但是仅有有限证据证明其在促进移植物生存方面的效应.在免疫耐受的实验性研究中，皮肤移植作为一项检查耐受状态的指标具有特殊意义，皮肤移植内部的树突状细胞及淋巴细胞的分布，其血管与受者连接的特殊性，使得同种异基因皮肤移植是最难获得移植耐受的组织，因此是检查耐受状态与耐受深度最可靠的指标.国外大多数耐受研究显示，皮肤移植存活只能获得有限延长，而且是建立在大量非特异免疫抑制处理的基础上.本试验利用口服供者脾细胞诱导异基因大鼠皮肤移植物存活期延长，并对口服抗原与未口服抗原组的体内DTH反应及体外的混合淋巴细胞增殖反应进行比较，对口服耐受的效应加以证实.本实验研究显示：Wistar大鼠口服供者脾细胞7 d后，体外混合淋巴细胞培养及体内的DTH反应均出现明显的抗原特异性免疫反应降低，而对无关第三者仅稍有降低，这可能源于口服抗原中的共同抗原的作用.通过对移植物存活时间的观察表明：口服异基因供者脾细胞可以使皮肤移植物的存活时间明显延长，虽未获得长期存活，但足以说明口服抗原在诱导受体对移植物耐受方面上的作用.
口服耐受形成的主要机制与克隆清除（clonal deletion）或克隆无能(clonal anergy)及克隆抑制(clonal suppression)有关［10，11］.口服抗原随着肠道到达小肠后逐渐被降解，在人类和啮齿类动物研究表明，抗原降解仅是一部分，仍有一些完整的抗原被吸收.吸收的抗原（包括未降解的以及部分降解的抗原）在口服耐受的形成中有重要作用.口服抗原后1 h从肠道吸收的抗原进入血浆，可使机体的迟发型超敏反应（delayedtype hypersensitivity，DTH）受到抑制.而抗原通过注射或直接加入到血浆中却不能抑制DTH反应，提示抗原经过胃肠道作用后使其具备了独特的耐受特性［12］.Matting和Waksman［13］观察到大鼠喂养绵羊红细胞2 wk，在肠相关淋巴组织及脾脏中可以产生抗原特异性的抑制细胞.而且，来自口服耐受动物的肠系膜淋巴结及脾脏的CD8+细胞可以有效的阻止试验性的自身免疫性的脑脊髓膜炎的发生.所以肠上皮细胞暴露于同种异体抗原后可以诱导来自肠相关淋巴组织的调节细胞抑制T辅助细胞功能并随后导致机体的MLC和DTH反应降低.
尽管利用口服抗原诱导受体对移植物耐受的研究还处于起步阶段，但国外已有成功的报导，如角膜移植［14］、肾脏移植［15］等.对于口服耐受的确切机制，人们还知之甚少，这种耐受产生的机制、程度以及在同种异体器官移植中的应用前景，值得进一步研究.如果明确了口服耐受的作用机制和影响因素，并有效的应用于临床，口服抗原诱导机体免疫耐受将是移植学发展史上又一具有重大意义的里程碑.
【
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