【关键词】 星形胶质细胞
关键词: 神经元;星形胶质细胞;免疫组织化学;大鼠;脑干
摘 要:目的 研究大鼠脑干内星形胶质细胞和神经元对一侧胫腓骨骨折的即刻应激反应及相互关系. 方法 应用细胞免疫组织化学三重标记法观察脑干内胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、Fos蛋白、酪氨酸羟化酶（TH）在左侧胫腓骨骨折后15，45，90，180和360min的表达变化. 结果 ①一侧胫腓骨骨折后，脑干星形胶质细胞GFAP阳性表达有明显的核团定位.在延髓内脏带（MVZ）、三叉神经脊束核尾侧亚核（Vc）、外侧楔束核（Ecu）、中缝大核（RMg）、蓝斑（LC）、臂旁外侧核（LPB）、中缝背核（DR）、中脑导水管周围灰质腹外侧区（vIPAG）等脑区内的星形胶质细胞GFAP阳性，而Fos阳性神经元的分布与此分布基本一致;②MVZ，LC等部位有大量Fos及TH双标阳性神经元，周围有密集的GFAP阳性细胞;③时间点上GFAP与Fos阳性产物的表达均先升高后又降低，前者表达高峰期在骨折后45min，而后者在90min，即前者表达高峰略为提前. 结论 上述核团的星形胶质细胞参与了下肢骨折伤害性刺激的应激反应及其调节过程，且其反应早于神经元，可能主动地影响神经元的活动.
Abstract:AIM To observe the instant stress reaction of as-trocytes and neurons in rat brain stems after the unilateral tibia and fibula bone fracture.METHODS With immunohis-tochemical triple staining method，the expression of Fos-pro-tein，glial fibrillary acidic protein and tyrosine hydroxydase was observed.RESULTS ①After the nociception of the treatment，GFAP-like immunoreactive astrocytes exhibited clear nuclei distribution characteristic in medullary visceral zone（MVZ），raphe magnus nucleus（RMg），lateral parabrachial nucleus（LPB），locus nucleus（LC），dorsal raphe nucleus（DR），lateral ventral part of periaqueductal gray（vlPAG）.Fos-like immunoreactive neurons had the similar distribution pattern.②There were many Fos and TH immunoreactive double labelled neurons in MVZ，LC，vl-PAG，DR，surrounded by GFAP-like astrocytes.③Fos-like（Fos-LI）and GFAP-like（GFAP-LI）immunoreactivity both were increased firstly，and then decreased after the peak time.The peak time of GFAP-LI was earlier than that of Fos-LI.CONCLUSION The astrocytes as well as neurons of the above nuclei or regions may be involved in the stress response and adjustment of the lower extremity bone fracture nociception simultaneously.
0 引言
传统观点认为痛觉是由神经元介导的，胶质细胞只起辅助作用.然而随研究不断深入，现已证实星形胶质细胞（astrocyte，AS）能够接受神经元的信息，在AS之间传递，并通过释放谷氨酸反作用于神经元从而对其功能发挥影响［1，2］ .目前有关胶质细胞对痛觉反应的研究开始有较多报道，但多采用sc化学刺激物的模型进行研究［3，4］ ，对外伤引起的即刻应激反应中AS对痛觉的反应及其与神经元的关系则未见报道.我们采用一侧胫腓骨骨折模型，通过免疫细胞化学等方法对刺激后AS和神经元反应的时间、空间规律及相互关系进行了探讨.
1 材料和方法
1.1 材料 SD成年雄性大鼠32只，体质量200～250g（由第四军医大学实验动物中心提供），在温暖（20℃）、安静的环境中饲养48h，注意避免非特异性应激反应的发生.
1.2 方法
1.2.1 实验组 将大鼠在清醒状态下造成一侧胫腓骨骨折，分别存活15，45，90，180和360min（n=6）后，用过量戊巴比妥钠（80mg kg-1 ，ip.）麻醉，迅速开胸经左心室至升主动脉插管，以100mL生理盐水冲去血液，4℃含40g L-1 多聚甲醛的0.1mol L-1 磷酸盐缓冲液（PB，pH7.4）先快后慢灌流固定2h，取脑干置于300g L-1 蔗糖中（4℃）直至组织沉底.冰冻切片机连续冠状切片，片厚30μm，分为4组，置于0.01mol L-1 PBS中存放.免疫组织化学染色如下:每只大鼠的切片按先后次序分为4组，分别行抗Fos、抗GFAP、Fos/GFAP双标及Fos/GFAP/TH三标的免疫组织化学染色.下面以三标为例简述染色过程.切片在0.01mol L-1 PBS中漂洗后，入含3g L-1 Tri-ton X-100的0.01mol L-1 PBS中浸泡30min（室温）.依次入①兔抗Fos抗体稀释液（1 3000，Santa Cruz），孵育48h（室温）;②生物素标记的羊抗兔IgG（1 500，Sigma）放置2h（室温）;③生物素-卵白素-HRP复合物（ABC，1 500，Sigma）浸泡2h（室温）.用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法呈色.以上每一步骤之后均用0.01mol L-1 PBS液充分漂洗3次，每次10min（下同）.显色后，切片继续用ABC法进行抗GFAP染色:①兔抗GFAP抗体稀释液（1 3000，Dako）孵育24h（室温）;②生物素标记的羊抗兔IgG（1 500，Sigma）放置2h（室温）;③生物素-卵白素-HRP复合物（ABC，1 500，Sigma）浸泡2h（室温）.用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法呈色.双标后的切片再进行抗TH的第三重染色:①小鼠抗TH mAb稀释液（1 5000Calblochem）中室温孵育24h;②生物素标记的驴抗小鼠IgG（1 500，Sigma）中室温孵育2h;③ABC复合物中室温孵育2h;④DAB-h3 O2 溶液中进行棕色反应.结束3次染色的切片经漂洗后裱片、晾干、脱水、透明，封固后在光镜下观察并照相.抗Fos、抗GFAP单标和Fos/GFAP双标的程序为上述三标法相应的一部分.
1.2.2 空白对照组 大鼠2只，不给予骨折刺激，仅行灌流固定、取材和免疫组织化学反应.
1.2.3 替代实验组 取实验组切片，用0.01mol L-1 PBS分别替代抗Fos、抗GFAP以及抗TH抗体稀释液，按ABC法进行免疫组化染色，结果均为阴性.
2 结果
2.1 动物的行为学变化 左下肢骨折后大鼠立即表 现痛苦，活动能力受限，并出现躁动不安，呼吸加快加深等表现.空白对照组的大鼠无上述改变.
2.2 光镜观察
2.2.1 GFAP单标切片 ①对照组:GFAP呈散在分布，阳性细胞的胞体小、突起细、染色浅淡.仅延髓内脏带（MVZ）、蓝斑（LC）、臂旁核（PB）有少量GFAP阳性细胞;②实验组:GFAP阳性细胞胞体肥大，颜色深染，突起变粗变长，主要集中分布于MVZ内的孤束核（NTS）（Fig1）、腹外侧延髓（VLM）（Fig2）、以及两者之间的中间带上（IRt）.三叉神经脊束核尾侧亚核（Vc）（Fig3）、外侧楔束核（Ecu）、蓝斑（LC）（Fig4）、臂旁外侧核（LPB）（Fig5）、中缝大核（RMg）、中脑导水管周围灰质腹外侧区（vlPAG）（Fig6）等部位也出现一定数量的GFAP阳性细胞.
2.2.2 Fos单标切片 ①对照组:对照组仅MVZ，LC有颜色浅淡的Fos免疫反应阳性细胞散在分布;②实验组:Fos阳性神经元胞核呈圆形或卵圆形，蓝黑色.其分布与GFAP阳性细胞基本一致，主要也集中在MVZ的NTS和VLM（Fig1，2），在Vc（Fig3），Ecu，LC（Fig4），LPB（Fig5），RMg，vlPAG（Fig6），中缝背核（DR）也有较多表达.
2.2.3 Fos/GFAP双标切片 在上述MVZ（Fig1，2），Vc（Fig3），Ecu，LC（Fig4），LPB（Fig5），RMg，vlPAG（Fig6）和DR可看到蓝黑色的GFAP阳性胞体和纤维密集分布于蓝黑色的Fos阳性胞体及血管的周围，两者分布基本一致.
2.2.4 Fos/GFAP/TH三标切片 可观察到以下几种结构:①Fos+/TH+/GFAP+三标记结构:神经元的圆形或卵圆型胞核呈蓝黑色，周围充满棕黄色的胞质，被GFAP阳性纤维包绕.此种结构集中分布在MVZ的NTS和VLM区;②Fos-/TH+/GFAP+二标记结构:神经元胞核Fos呈阴性，胞质TH染色阳性，周围也有GFAP阳性纤维分布，但比较稀疏.分布于MVZ的NTS和VLM（Fig1，2）;③Fos+/TH-/GFAP+二标记结构:深染的胞核周围也可见GFAP阳性纤维.该类型数量最多，在MVZ，Vc，LC，LPB，RMg，vlPAG密集分布（Fig1～6），DR也有散在分布.
2.2.5 阳性产物表达时间的变化规律 对同一部位各个时间点的切片中GFAP阳性产物进行图像分析，发现灰度阈值相同的条件下，阳性产物面积大小（即反应强弱）的顺序为:45min&>90min&>180min&>15min&>360min.计数同一部位各个时间点Fos阳性细胞核的个数，则发现同样存在先升高后降低的情况，但最高峰时间推迟到90min.即反应强弱的顺序为:90min&>45min&>180min&>15min&>360 min.以NTS为例，统计结果见Fig7.
3 讨论
3.1 脑干星形胶质细胞与神经元反应的意义 骨折位于下肢，而脑干内许多核团的星形胶质细胞和神经元都明显表现反应状态，这可能有以下意义:①激活的神经元和AS参与痛觉信息传导.脑干内许多核团都参与躯体伤害性刺激信息的传导及调制.例如传导下肢伤害性刺激的二级神经元胞体就位于Ecu，而Vc与NTS是内脏与躯体伤害性刺激信息传入与汇聚的部位;②作为应激反应调节中枢.MVZ，LC，vl-PAG等核团与心血管活动及应激反应调节关系密切，而骨折时有失血（可导致血容量降低和渗透压升高）和心理应激，故相应核团也会有一定的表达;③相关镇痛中枢的激活.在脑干以中线结构为中心（主要由PAG，DR和RMg组成），是重要的痛觉调制结构，与镇痛关系密切，而本实验Fos阳性神经元和GFAP阳性胶质细胞分布与上述中线结构基本吻合.
3.2 胶质细胞与神经元反应的时间规律及意义 本实验结果显示Fos表达以骨折后90min为最高峰，GFAP虽也有相似的升降变化，但高峰时间却早于神经元，用AS增生显然难以解释.我们认为可能是由于AS兴奋后GFAP发生去磷酸化改变，分子结构由聚合状态解聚，导致GFAP抗体结合位点暴露所致，但具体机制尚需进一步探讨.既然AS兴奋的标志物表达峰值时间早于神经元，表明未必只有传统认为的神经元兴奋后再激活胶质细胞，可能还存在神经元与胶质细胞同时兴奋，甚至胶质细胞兴奋后激活神经元的信息传递模式.
3.3 胶质细胞与神经元的密切关系及意义 Re-ichenbach等［7］ 发现在视网膜存在以Müller细胞（一种胶质细胞）为中心，与周围神经元密切相连组成的柱状复合体结构，并认为这是视网膜的代谢-功能单位.Grosche等［8］ 证实在小脑Bergmann氏细胞突起上存在神经元-胶质细胞交流的结构 mi-crodomain.我们也在电镜水平证实AS突起与神经元胞体、树突或轴突终末之间发生接触，其接触区有膜电子密度增高点，可能就是信息交流的部位，因为在刺激后这种高密度点数目明显增多（将另文报道）.另有学者报道在LC自然状态下记录到的AS膜电位与神经元活动是同步的，并相互影响［9］ ，因此我们认为以神经元为中心，周围包绕星形胶质细胞，共同构成神经元与星形胶质细胞复合体（neuron-astro-cyte comples，N-ASC）.N-ASC能够通过神经元的树突或AS的胶质突从其他N-ASC接受传入信息，另外也可能从血液或脑脊液中接受信息.而各种信息在N-ASC内部的神经元与AS之间交流整合后，可进一步经由轴突传至相应靶区的N-ASC，这就形成了中枢神经系统的调节机制.
中枢神经系统由神经元与胶质细胞组成，两者关系密不可分.将神经元与胶质细胞作为一个整体进行研究，将有助于更准确、更科学地认识和反映中枢神经系统的结构与功能.
参考文献:
［1］Pastil L，Volterra A，Pozzan T，Carmignoto G.Intracellular calcium oscillations in astrocytes:A highly plastic，bidirectional form of communication between neurons and astrocytes in situ ［J］.J Neurosci，1997;17（20）:7817-7830.
［2］Verkhratsky A，Kettenmann H.Calcium signaling in glial cells ［J］.Trends Neurosci，1996;19:346-352.
［3］Fang XY，Hu HT，Lu SG，Wang WX.Influence of peripheral noxious stimulation on rat hippocampal neurons ［J］.Shenjing Jiepouxue Zazhi（Chin J Neuroanat），1998;14（4）:385-388.
［4］Wu SX，Wang YY，Li YQ，Shi JW.Preprotachykinin A mRNA expression changes and colocalization with fos-like immunoreac-tivity in the neurons of caudal spinal trigeminal nucleus follow-ing orofacial inflammation ［J］.Shenjing Jiepouxue Zazhi（Chin J Neuroanat），1998;14（4）:359-362.
［5］Eliasson C，Sahlgren C，Berthold CH，Stakeberg J，Celis JE，Betsholtz C，Eriksson JE，Pekny M.Intermediate filament pro-tein partnership in astrocytes ［J］.J Biol Chem，1999;274:23996-24006.
［6］Eddleston M，Mucke L.Molecular profile of reactive astro-cytes-implications for their role in neurologic disease ［J］.Neu-roscience，1993;54:15-36.
［7］Reichenbach A，Stolzenburg JU，Eberhardt W.What do retinal muller（glial）cells do for their neuronal `small siblings`?［J］.J Chem Neuroanat，1993;6:201-213.
［8］Grosche J，Matyash V，Moller T，Verkhratsky A，Reichenbach A，Kettenman H.Microdomains for neuron-glia interaction:Parallel fiber signaling to Bergmann glial cells ［J］.Nature Neurosci，1999;2（2）:139-143.
［9］Veronica AM，Fernando GH，John TW，Elisabeth VB.Func-tional coupling between neruons and glia ［J］.J Neurosci，2000;20（11）:4091-4098.