作者：沈瑞雄，邵国兴，王禾，石炳毅，王强
【关键词】 细胞活素类
【Abstract】AIM： To induce immune tolerance in recipient rats of allogenic kidney transplantation with hydrocamptothecin (HCPT) and cyclosporin A (CsA) and to study the mechanism of the tolerance. METHODS: The inbred DA rats were chosen as kidney donors and Lewis rats as recipients. After transplantation， the recipients were treated with HCPT and/or CsA. The levels of cytokine expression were assessed using RTPCR. RESULTS: 4 out of 10 in group C (HCPT 2.0 mg) and 5 out of 10 in group E (HCPT+CsA) survived longer than 150 days even immunosuppression (HCPT and CsA) was withdrawn at 30 days after transplantation. The levels of IL2 and IFNγmRNA expression were significantly lower in the tolerant rats than those in rejected rats. The levels of IL4 and IL10 mRNA were significantly higher in the tolerant rats than those in rejected rats. The level of cytokine mRNA expression in the grafts was similar to that in the spleen. CONCLUSION: High dosage of HCPT or low dosage of HCPT combined with CsA can induce tolerance in allogenic kidney transplantation in the recipients. Cytokine deviation is in some way responsible for the allogenic kidney transplantation immune tolerance induced by hydrocamptothecin. The level of cytokine mRNA expression in the grafts is similar to that in the spleen of recipients.
【Keywords】 camptothecin; immune tolerance; cytokines; transplantation; rats
【摘 要】 目的： 以羟基喜树碱（HCPT）和环孢素A（CsA）诱导异基因大鼠肾脏移植免疫耐受，并探讨免疫耐受的形成机制. 方法: 以近交系DA大鼠为供者，近交系Lewis大鼠为受者行同种异体原位肾脏移植.移植后受者大鼠接受不同剂量HCPT，CsA治疗或二者联合应用.应用RTPCR方法检测移植物内及受者脾内细胞因子mRNA表达情况.结果: 各组移植后存活时间显著长于对照组.C组（HCPT 2 mg-1・ kg ・d-1）中4/10和E组（HCPT 10 mg・kg-1 ・d-1 +CsA 10 mg ・kg-1 ・d-1）中5/10受者大鼠形成特异性免疫耐受.耐受组IL4，IL10 mRNA表达明显高于排斥组，而IL2，IFNγ明显低于排斥组.受者脾内细胞因子表达量近似于移植物内.结论:大剂量HCPT或小剂量HCPT与CsA合用可诱导异基因大鼠肾脏移植免疫耐受.细胞因子偏向Th3亚类是免疫耐受形成机制之一.受者脾内细胞因子mRNA表达与移植物内表达近似.
【关键词】 喜树碱; 免疫耐受; 细胞活素类; 移植；大鼠
0 引言
随着免疫抑制治疗的进展，临床器官移植取得很大进步，但目前应用的免疫抑制是以牺牲机体整体免疫功能为代价［１］，且有毒副作用，寻找新型的免疫抑制剂和诱导受者对供者抗原的特异性耐受是当前移植学急需解决的两大问题.前期研究证实羟基喜树碱（Hydrocamptothecin ，HCPT）独用或HCPT与环孢霉素A（Cyclosporin A，CsA）合用可明显延长大鼠异基因心脏［２］、肾脏移植存活时间，并可使部分受者形成特异性免疫耐受.为进一步探讨免疫耐受形成机制，了解细胞因子在其中的作用，我们应用RTPCR技术检测移植物内及受者脾细胞内mRNA 表达情况.
1 材料和方法
1.1 材料 供体为42只雄性DA大鼠 8～10 wk龄， 体质量(200±10) g，受体为42只雄性Lewis大鼠 ，8～10 wk龄， 体质量(200±10) g ，购自北京大学动物中心，SHR大鼠购自北京大学人民医院高血压病研究所.HCPT，贵州中联业药有限公司产品.CsA（Neoral），瑞士Novartis公司产品.总RNA提取试剂盒（TRIZOL Reagent）GIBRO BRL公司产品 .RNA逆转录试剂盒（cDNA的合成）Promega公司产品.所用引物由上海生工合成.
1．2 方法
1．2．1 动物分组 A组（对照组）: 移植后不接受任何治疗；B组: HCPT 10 mg ・kg-1，ip，1次・d-1；C组:HCPT 20 mg ・kg-1，ip，1 次・d-1；D组: CsA 10 mg ・kg-1 ，ig，1 次・d-1;E组:HCPT 10 mg ・kg-1，ip，1次・d-1，加CsA 10 mg ・kg-1 ，ig，1 次・d-1.
1．2．2 肾脏移植 采用改进的Kamada［3］方法，利用显微外科技术行原位左侧肾脏移植法，供体肾静脉与受体肾静脉行端端吻合、供体肾动脉（带有部分腹主动脉壁）与受体腹主动脉行端侧吻合，供体输尿管连同部分膀胱壁与受体膀胱行双层吻合.术中用冰屑保持供肾处于低温状态，移植肾缺血时间约60 min.移植后切除右肾.
1．2．3 皮肤移植 9只移植后存活超过130 d的Lewis大鼠同时接受DA大鼠和第三品系供者SHR大鼠的皮肤，在供者腹部取15 cm × 15 cm的全厚皮片，DA大鼠皮肤移植于受者左季肋部，SHR大鼠皮肤移植于受者右季肋部.
1．2．4 移植物及受者脾脏细胞因子mRNA检测 对9只形成特异性免疫耐受的Lewis大鼠在存活150 d时全部拉颈处死，浸泡于750 mL ・L-1中2 min.无菌取移植肾及脾脏，液氮速冻后保存于-80℃冰箱中待检测.A组中6只大鼠在死亡后立即留取标本.总RNA提取 按照GIBRO BRL公司提供的RNA提取试剂盒（TRIZOL Reagent）的说明进行.RNA的逆转录（cDNA的合成）按照Promega公司逆转录试剂盒的说明进行.PCR扩增cDNA特异性引物序列及退火温度见Tab 1，在25 μL反应体系中进行，包括250 μmol・L-1每种dNTP，10 μmol・L-1引物，25 U 10×PCR缓冲液，05 U Taq DNA聚合酶.94℃变性1 min，72℃延伸1 min，循环35周期.用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物 含05 μg ・mL-1 EB的15 g ・L-1琼脂糖凝胶，电泳2 h.在凝胶成像分析系统上检测并照相，以目的基因/βactin 密度为内对照判断各基因的表达量.
统计学处理：生存时间组间比较用logrank检验，mRNA表达指标组间比较用t′检验.
2 结果
2．1 大鼠存活时间 各组存活时间明显长于对照组（χ2=8574，P&<001），HCPT 20 mg ・kg-1组中4只和HCPT 1 mg ・kg-1 + CsA 10 mg ・kg-1 组5只存活时间＞150 d(Tab 2).
2.2 皮肤移植存活情况 9只停用免疫抑制剂后肾脏移植物长期存活的大鼠于术后130 d同时行双侧不同供者的皮肤移植，左季肋部肾脏供者相同品系（DA大鼠）皮肤全部存活超过20 d，而右季肋部第三品系供者（SHR大鼠）共9块全部于术后2～4 d发生急性排斥反应.
2.3 细胞因子的mRNA表达情况 各细胞因子的mRNA表达情况见Tab 3.
表1 细胞因子特异性引物及反应条件（略）
Tab 1 cytokine primer and reactive condition（略）
表2 移植后大鼠存活时间（略）
Tab 2 Survival time after transplanted（略）
表3 移植物内细胞因子的mRNA表达量（略）
Tab 3 Quantitative of cytokine mRNA expression in allograft（略）
HCPT是从珙桐科植物喜树中提取出的一种生物碱，研究证实为DNA拓扑异构酶的抑制剂［４］ ，可通过抑制DNA的复制而抑制细胞的增殖，临床上用于抗肿瘤治疗［5］.本组中B组应用HCPT 1 mg ・kg-1明显延长了异基因移植大鼠的存活时间，但在用药过程中均发生了移植肾脏排斥，说明小剂量HCPT可有一定的免疫抑制作用，但不能使移植肾脏长期存活.D组应用CsA 10 mg ・kg-1使存活时间进一步延长，用药期间无一例死亡，但均在停药后30 d左右死亡，说明CsA 10 mg・kg-1足以抑制同种肾移植排斥反应，但不能诱导供体特异性耐受.而E组(HCPT+CsA)存活时间进一步延长，且有5只形成特异性免疫耐受，说明HCPT协同CsA免疫抑制作用，并促使免疫耐受形成.C组应用HCPT 2 mg ・kg-1用药期间无一例死亡，停药后四只形成特异性免疫耐受，表明HCPT不仅能抑制大鼠同种肾移植排斥反应，还能促使供体特异性耐受形成.本组中未形成耐受者最长存活时间不超过90 d，而存活时间超过130 d者均特异性的接受原品系供者皮肤移植，推测停用免疫抑制药物后60 d，如无排斥表现，基本可判断免疫耐受形成，我们正在进一步的实验证明之，并探讨停药指标.
Th细胞可分为二个不同极向性的功能亚群［6］ ，其中以分泌IL2和IFNγ为主的称为Th1，介导细胞免疫和移植物排斥等［7］ ，而Th3细胞主要分泌IL4和IL10，介导体液免疫和过敏反应，并利于移植物的存活［8］ .由于二个亚群所分泌的细胞因子互为拮抗，任一亚群皆可通过自分泌或旁分泌促进同亚群细胞增殖，并遏制另一亚群的增殖及功能发挥.例如Th3占优势时，可通过分泌IL10等细胞因子抑制Th1亚群的增殖，造成细胞免疫包括同种异体应答受阻.本组中9只形成耐受 的大鼠IL4和 IL10明显高于排斥组及正常对照，而IL2 和IFNγ则明显低于排斥组.说明细胞因子偏向Th3亚类可能是HCPT或HCPT+CsA诱导大鼠肾脏移植免疫耐受机制之一.
CsA的作用机制在于阻断IL2基因活化通路，使IL2的合成减少.本组中E组IL2 mRNA表达显著降低，提示在较强的免疫抑制下，尤其是在结合抑制IL2基因活化的CsA的作用下Th1细胞增殖减少，Th3增殖增加. 有报道HCPT在低浓度下抑制淋巴细胞增殖，在较高浓度下则迅速引起淋巴细胞凋亡［9，10］.本实验C组中4只形成耐受的大鼠未应用IL2抑制剂CsA，移植物中细胞因子mRNA表达与E组无明显差异，也偏向Th3亚类（数据未列出），推测其原因可能是HCPT致使淋巴细胞凋亡时Th1 Th3类细胞不平衡所致，尚需进一步实验证实.
分析受者脾内细胞因子mRNA表达情况，与移植物内mRNA表达呈明显的正相关（数据未列出），提示有可能通过采取受者外周血淋巴细胞判断移植物内细胞因子表达情况.
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