作者：付洛安 章翔 李侠 费舟 郭衍 高大宽
【关键词】 神经胶质瘤
关键词: 神经胶质瘤;基因;脱噬作用;bcl-2
摘 要:目的 探讨PTEN基因对人脑胶质瘤SHG-44细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2表达的影响，阐明PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机制. 方法 PTEN基因体外转染SHG-44细胞，筛选阳性细胞克隆，以原位杂交、免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况;采用透射电镜、流式细胞仪和核DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞的凋亡情况;以免疫荧光法检测bcl-2基因的表达. 结果 PTEN基因转染的SHG-44细胞有PTEN蛋白的表达.透射电镜下可见转染PTEN基因后细胞核染色质浓缩边集、胞质浓缩、核碎裂及凋亡小体形成等典型的凋亡表现;流式细胞仪显示细胞周期从G1 期到S期发生抑制，并且在G1 期峰前出现一明显的凋亡峰（15.9%）;细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳呈现凋亡细胞特有的梯状条带;bcl-2的表达也显著下调. 结论 PTEN基因可诱导SHG-44细胞凋亡，并下调bcl-2蛋白的表达，这可能是PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的分子机制之一.
Keywords:glioma;genes;apoptosis;genes，bcl-2
Abstract:AIM To investigate the effects of exotic PTEN on the apoptosis and expression of bcl-2gene in human brain glioma SHG-44cells and to probe into the mechanism that PTEN gene inhibits the proliferation of the tumor cells.METHODS Human glioma SHG-44cells were transfected with a plasmid vector containing PTEN gene in vitro，and then positive cell clones were selected and amplified.The ex-pression of PTEN gene was examined by in situ hybridization and immunohistochemistry methods.To detect the apopto-sis，examinations of transfected cells were performed by transmission electronic microscope，flow cytometry and nu-cleus DNA agarose gel electrophoresis.The expression of bcl-2was also detected by immunofluorescent methods.RE┐SULTS SHG-44cells stably transfected with PTEN gene were obtained by selection，and expression of PTEN gene was able to be detected.Apoptosis body and changes of ul-trastructure，including the concentration，side-accumulation of the nuclear chromatin and the fragmentation of the nucle-ar，were detected by transmission electron microscope.Cell cycle detected by flow cytometry showed that the percentage of cells increased in G1and decreased in S phase.One visible apoptosis peak（15.9%）prior to the peak of G1also was found by FCM.The characteristic DNA ladder was found in the agarose gel electrophoresis of the nucleus DNA of trans-fected cells.The expression of bcl-2gene was down-regulat-ed in SHG-44cells.CONCLUSION PTEN gene SHG-44cells can induce apoptosis and down-regulation of expression of bcl-2gene in SHG-44cells，which may be one of the rea-sons that PTEN gene inhibits the proliferation of human tu-mor cells.
0 引言
PTEN基因是1997年发现的定位于人体第10q23染色体上的肿瘤抑制基因，人类多种肿瘤组织中伴有该基因的缺失［1］ .许多学者已研究了人脑胶质瘤标本和细胞系中PTEN基因的变异，其中Duerr等［2］ 以SSCP和直接测序法研究了331例胶质瘤中PTEN的表达，发现10q23染色体上PTEN基因位点杂合性缺失（LOH）发生频率较高，提示该基因的突变或缺失可能与胶质瘤的发生和进展密切相关.我们将外源性人PTEN基因导入该基因缺失的SHG-44胶质瘤细胞系中，以揭示外源性PTEN基因对人脑胶质瘤细胞系凋亡和凋亡相关基因bcl-2表达的影响，探讨PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的分子机制.
1 材料和方法
1.1 材料 SHG-44胶质瘤细胞系（苏州医学院）;RPMI1640培养基、胰蛋白酶（Hyclone）;脂质体lipo-fectamine（Gibco）;嘌呤霉素（Clontech）;pBP-PTEN及pBP质粒（美国Furnari博士惠赠）;各种限制性内切酶（Clontech）;鼠抗人PTEN单抗，鼠抗人bcl-2单抗（Santa Cruz）;FITC标记的羊抗鼠IgG（Jackson），6wk龄BALB/c裸鼠（第四军医大学实验动物中心）.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及基因转染 SHG-44细胞常规条件下培养于100mL L-1 小牛血清RPMI1640培养基中.真核表达载体pBP-PTEN及对应的空载体pBP转化DH5α菌株，挑选氨苄抗性的克隆，扩赠培养，碱裂解法提取纯化质粒DNA.脂质体介导法将pBP-PTEN和pBP载体分别转染对数生长期的SHG-44细胞.筛选培养基中嘌呤霉素浓度为2mg L
-1 ，维持筛选30d，挑选阳性细胞克隆，扩增培养.分别将成功转染pBP-PTEN和pBP载体的SHG-44细胞命名为SHG44-pBP-PTEN和SHG44-pBP细胞.
1.2.2 PTEN基因表达的检测 pBP-PTEN经EcoRⅠ和ClaⅠ双酶切以后，回收1212bp的人全长PTEN基因片断，随机引物法标记杂交探针，利用原位杂交方法分别检测SHG44-pBP-PTEN，SHG44-pBP和SHG44细胞.同时用免疫组化方法检测PTEN蛋白在上述3种细胞中是否表达.一抗为鼠抗人PTEN单克隆抗体，1 1000稀释，具体操作见博士德公司SABC试剂盒说明书.以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照.
1.2.3 细胞周期、超微结构、生长速率及核DNA电泳检测 3种细胞分别经2.5g L-1 胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，进行下列检测:①各取约1×106 个细胞，PBS洗涤2遍，预冷的750mL L-1 乙醇固定，PI染色，流式细胞仪行细胞周期检测.②各取约1×106 个细胞，1000r min-1 离心5min，细胞沉淀以20g L-1 戊二醛固定，常规包埋，切片，双铅染色后透射电镜检测.③分别接种于6孔板，每种细胞接种7孔，每孔约1×104 个细胞，每日取1孔细胞进行计数，绘制细胞生长曲线.④各取约1×106 个细胞，PBS洗涤2遍后，采用氯仿-酚抽提法提取细胞核DNA，取15μL核DNA上样，行15g L-1 琼脂糖凝胶电泳细胞核DNA分析，EB染色后紫外灯下观察. 1.2.4 bcl-2蛋白表达的检测 3种细胞各约1×106 个，40g L-1 多聚甲醛固定，含1mL L-1 Triton X-100的PBS在4℃下作用5min，加入1 80稀释的鼠抗人bcl-2单抗，室温孵育，再加入1 100稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，利用流式细胞术检测bcl-2特异性细胞的平均荧光强度（MIF），以判断bcl-2表达情况.SHG44细胞作为对照，计算SHG44-pBP-PTEN和SHG44-pBP细胞MIF与对照细胞MIF的比值.阴性对照为SHG44细胞不加鼠抗人bcl-2单抗，代之以小鼠IgG.
统计学处理:数据以SPSS统计软件包进行χ2 检验.
2 结果
2.1 PTEN基因转染SHG┐44细胞 成功将pBP-PTEN和pBP载体转染入SHG44肿瘤细胞，获得阳性转染的细胞克隆，相差显微镜下SHG44-pBP-PTEN，SHG44-pBP与SHG44三种细胞之间，形态无明显差异.
2.2 PTEN表达的检测 原位杂交显示仅SHG44-pBP-PTEN细胞有PTEN基因mRNA的表达（Fig1A，1B）.免疫组化显示:SHG44-pBP和SHG-44细胞中PTEN蛋白阴性，而SHG44-pBP-PTEN细胞中该蛋白表达阳性，可见胞质中大量的棕黄色颗粒（Fig1C，1D）.
表1 流式细胞仪显示细胞周期变化 略
2.3 PTEN基因对SHG┐44细胞周期、超微结构、生长速率及核DNA电泳的影响 ①流式细胞仪检测细胞周期显示SHG44-pBP-PTEN细胞的G1 期细胞数量增加，S期细胞减少，从G1 期到S期发生抑制，G1 峰左侧出现凋亡峰（AP），所占比例为15.9%.SHG-44和SHG44-pBP细胞周期正常（Tab1）.②3种细胞生长曲线可见SHG44-pBP-PTEN细胞的生长曲线平缓，生长速度较另两种细胞明显降低（Fig2）.③透射电镜下，可见SHG44-pBP-PTEN细胞核染色质浓缩、边集，呈境界清晰的块状或半月状，亦有细胞核碎裂，胞质浓缩;胞质内细胞器较完整，并检测到明显的凋亡小体，为典型的肿瘤细胞凋亡表现.SHG-44和SHG44-pBP细胞超微结构未见异常（Fig3）.④细胞核DNA电泳分析可见SHG44-pBP-PTEN细胞核DNA裂解为180～200bp及其整倍数的寡核苷酸片段，形成典型的阶梯状电泳图谱（DNA ladder）.SHG-44及SHG44-pBP细胞核DNA仅在加样孔附近出现基因组条带，无DNA ladder形成（Fig4）.
2.4 bcl┐2表达水平变化 流式细胞仪分析结果显示:SHG44-pBP-PTEN细胞的MIF为对照细胞MIF的40.2%（P&<0.01）;而SHG44-pBP细胞的MIF为对照细胞MIF的100.4%.结果表明PTEN基因转染可明显抑制细胞bcl-2蛋白的表达.
图4 略
3 讨论
研究表明PTEN基因位于人类第10q23染色体上，具有9个外显子，其序列内含有由1212个核苷酸组成的开放阅读框，编码403个氨基酸组成的蛋白质［3］ .Chiariello等［4］ 检测了41例原发性胶质母细胞瘤中PTEN基因的表达，结果显示59%的标本中存在10q23染色体上PTEN位点的杂合性缺失.也有学者比较了不同病理等级胶质瘤中PTEN的表达量，证实低分化胶质瘤中PTEN的突变率明显高于高分化肿瘤，提示PTEN的突变与胶质瘤的恶性进展密切相关.
目前有关PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机制尚不明晰，但有研究认为PTEN可能是一种凋亡诱导基因.本实验将PTEN基因体外转染SHG-44胶质瘤细胞系，筛选阳性转染的细胞克隆后作相关检测，结果证实转染PTEN基因的SHG44胶质瘤细胞周期明显改变，细胞从G1 期到S期发生抑制，并且在G1 期前出现了明显的凋亡峰.细胞透射电镜显示染色质浓缩并边集于核膜，形成境界分明的颗粒块状或新月形小体，细胞质也浓缩，有的胞核裂解成质膜包绕的碎片，并脱落形成凋亡小体，为明显的凋亡表现.氯仿-酚抽提法提取细胞核DNA行1.5g L-1 琼脂糖凝胶电泳，于PTEN基因转染组细胞泳道上发现了典型的“梯状”条带，这是由于细胞凋亡时核小体间连接部双股螺旋断裂形成多个180～200bp及其整数倍大小的寡核苷酸碎片，因此会在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现典型的“梯状”条带，目前认为这是细胞凋亡的特征性变化之一.以上实验结果均证实PTEN基因可诱导SHG-44人脑胶质瘤细胞凋亡.诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制较为复杂，其中下调凋亡抑制基因的表达是一种重要的分子机制.bcl-2蛋白是一种膜结合蛋白，存在于细胞的线粒体、核膜和内质网膜上，其抑制凋亡的作用目前已得到公认［6］ .有学者证实bcl-2能拮抗bax等介导的肿瘤细胞凋亡［7］ .本研究在证实PTEN基因可诱导肿瘤细胞凋亡的同时，检测到bcl-2蛋白的表达下调，提示PTEN基因诱导的肿瘤细胞凋亡可能是通过下调bcl-2的表达而实现的.
综上所述，PTEN基因是与脑胶质瘤发生和发展密切相关的一种抑癌基因，将其导入到该基因缺失的胶质瘤细胞系中，可下调bcl-2蛋白的表达，并进一步诱导肿瘤细胞的凋亡，这将为胶质瘤的基因治疗提供新的实验依据.
参考文献
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