【关键词】 下丘脑
关键词: 应激;下丘脑;血管紧张素原mRNA;原位杂交
摘 要:目的 观察应激时大鼠下丘脑血管紧张素原mRNA表达及血管紧张素Ⅱ含量的变化. 方法 雄性大鼠48只随机分为3组，游泳组予以4℃～6℃冷水游泳刺激;电击组予以0.5～2Hz，60～100V足底电刺激，每日2次，每次2h，持续1wk;对照组不予任何刺激.用原位杂交技术及放免分析法检测不同应激时大鼠下丘脑血管紧张素原（Ang）mRNA的表达及血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）含量的变化. 结果 应激大鼠下丘脑Ang mRNA阳性表达面积百分比与积分吸光度均显著增高.游泳组（2.48±0.40）%与（0.75±0.09），电击组（2.94±0.82）%与（1.83±0.41）vs对照组（0.20±0.04）%与（0.24±0.12），P&<0.01;AngⅡ含量也显著增高.游泳组（141±67）ng g
-1 ，电击组（84±25）ng g-1 vs对照组（56±16）ng g-1 ，P&<0.01，P&<0.05，且Ang mRNA表达增高率（1216±196）%和（1441±402）%，超过了AngⅡ含量的增高率（295±118）%和（149±44）%，P&<0.01. 结论 应激时下丘脑肾素-血管紧张素系统（RAS）被显著激活，进一步支持局部RAS参与了应激反应的观点.
Keywords:stress;hypothalamus;angiotensinogen mRNA;in situ hybridization
Abstract:AIM To investigate the expression of an-giotensinogen（Ang）mRNA and the changes of angiotensinⅡ（AngⅡ）contents in rat hypothalamus during stress.METHODS Forty-eight male rats were randomly allocated to three groups.Swimming rats were treated with swimming stimulation in4℃～6℃cold water;electric shock rats were treated with repetitive0.5～2Hz，60～100V electric shock on foot for1wk，twice a day for2h each time;and control rats weren’t treated with any stimulation.Then Ang mRNA expression in hypothalamus was determined by using in situ hybridization technique，and AngⅡcontents were detected by RIA.RESULTS The area percentage and integral ab-sorbance of Ang mRNA positive expression were significantly increased ［swimming group（2.48±0.40）%and（0.75±0.09），electric shock group（2.94±0.82）%and（1.83±0.41），vs control group（0.20±0.04）%and（0.24±0.12），P&<0.01］，AngⅡcontents were also significantly increased ［swimming group（141±67）ng g-1 ，electric shock group（84±25）ng g-1 ，vs control group（56±16）ng g-1 ，P&<0.01，P&<0.05］，and the increased rates of Ang mRNA ［（1216±196）%and（1441±402）%］surpassed the ones of AngⅡcontents ［（295±118）%and（149±44）%］（P&<0.01）.CONCLUSION The local renin-angiotensin system（RAS）in hypothalamus is obviously activated during stress，which strongly supports the view that local RAS contributes to stress reaction.
0 引言
应激反应仍然是当代的研究热点［1-6］ .下丘脑是经典应激系统下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统重要组成部分，在应激反应中起着关键作用，我室系列研究证明各种应激情况下，循环与组织（包括下丘脑）血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）含量显著增高［7］ ，并提出循环与组织RAS可能参与了应激反应的观点.但对于下丘脑等组织AngⅡ含量的增高，是仅受血中AngⅡ增高的影响，还是组织局部肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）本身确有激活，则未曾作深入研究.我们采用原位杂交技术观察应激时大鼠下丘脑血管紧张素原（angio-tensinogen，Ang）mRNA表达情况，旨在确定应激时下丘脑局部RAS有无激活，以及激活的程度，以对下丘脑中枢RAS在应激时的作用作出评价，为RAS是否参与了应激反应提供进一步的实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料 健康雄性SD大鼠，体质量250～350g，由武汉大学医学院实验动物中心提供.125 I-AngⅡ放免分析测定盒购自中国同位素公司北方免疫试剂研究所;即用型链霉亲和素过氧化物酶溶液及过氧化物酶阻断剂购自福州迈新公司;血管紧张素原（Ang）mRNA探针为24碱基寡聚核苷酸，序列为5’-AAA GGG GTG GAT GTA TAC GCG GTC-3’，由上海生工生物工程有限公司合成，探针用biotin在5’端标记.γ-计数器为美国Packard公司产B5002-01型;图像分析仪为国产HPIAS-1000型.
1.2 方法 动物在实验1wk前于室温环境适应，然后随机分为3组:①急性冷水游泳组:4℃～6℃冷水游泳至力竭（约20min）立即处理;②慢性电击组:采用间断足底电击作为应激源.输出电压为60～100V，不定时改变电压，频率0.5～2Hz.每日上下午各2h，持续1wk，8d（停止电击后约18h）处理;③对照组:与应激大鼠同条件饲养，但不予任何刺激.血浆及下丘脑AngⅡ含量测定用放免分析法.大鼠处死后收集血液约5mL（制备血浆），取下丘脑组织匀浆，经0.5moL L-1 醋酸提取，上清液用双蒸水稀释10倍，按试剂盒说明测定AngⅡ含量.下丘脑Ang mRNA表达的测定用原位杂交法.40g L-1 多聚甲醛心脏灌流固定成功后，取下丘脑组织石蜡包埋.切片3μm，脱蜡后经过氧化物酶阻断剂和25mg L-1 蛋白酶K处理，滴加3mg L-1 探针杂交液，密盖后于50℃湿盒内6h，加链霉亲和素-过氧化氧化物酶溶液于37℃湿盒内15min，DAB液显色，自来水冲洗中止反应，苏木素复染.取相邻的组织切片同时做空白对照（杂交液中不含探针）和阴性对照（预先用10mg L-1 RNA酶消化40min）实验.阳性杂交结果显示胞质呈棕黄色颗粒状，复染后胞核蓝染，空白和阴性对照片未见棕黄色颗粒，采用图像分析法定量检测每张标本阳性细胞颗粒面积百分数和积分吸光度（A值）两个指标，每个指标均随机取5个视野，均值作为其测量值.
统计学处理:实验数据用x ±s表示，以t检验进行统计学分析.
2 结果
2.1 血浆及下丘脑AngⅡ含量变化 应激大鼠（包括游泳组和电击组）血浆AngⅡ含量显著高于对照 组（P&<0.01，P&<0.05），其中以游泳组更为显著;下丘脑AngⅡ含量也显著高于对照组（P&<0.01，P&<0.05），表明大鼠在急性和慢性应激时下丘脑AngⅡ含量均显著增高（Tab1）.
表1 应激大鼠血浆及下丘脑血管紧张素Ⅱ含量变化 略
2.2 下丘脑Ang mRNA表达的变化 对照组大鼠下丘脑Ang mRNA阳性细胞颗粒所占面积百分数与积分吸光度分别为（0.20±0.04）%和0.24±0.12;应激大鼠游泳组和电击组则分别为对照组的（1216±196）%，（312±38）%（P&<0.01）和（1441±402）%，（762±171）%（P&<0.01），均显著高于对照组，表明大鼠在急、慢性应激时下丘脑Ang mRNA表达显著增强（Fig1，Tab2）.
图1 略
表2 应激大鼠下丘脑Ang mRNA表达的变化 略
2.3 下丘脑AngⅡ含量与Ang mRNA的表达 应激大鼠游泳组与电击组下丘脑Ang mRNA表达的增高率均超过了AngⅡ含量的增高率（P&<0.01，P&<0.05，Tab3）. 表3 应激大鼠下丘脑Ang mRNA表达增高率与AngⅡ含量增高率比较 略
3 讨论
血管紧张素原（Ang）是RAS中的一个重要成分.下丘脑等组织存在独立的组织RAS，并有Ang mRNA的表达，而局部Ang mRNA表达增强乃为组织RAS激活的有力证明［8-10］ .我们观察到应激时下丘脑AngⅡ含量及Ang mRNA表达显著增强，说明应激时下丘脑局部RAS确实激活.并且发现Ang mRNA表达增高率超过AngⅡ含量增高率，由于血脑屏障的作用，循环AngⅡ不能进入脑部，因此，应激时下丘脑增高的AngⅡ是局部RAS激活的结果，其局部RAS可能是通过改变局部AngⅡ的浓度来起作用的.下丘脑是调节植物神经活动的主要脑区之一，应激时中枢神经系统依靠下丘脑等各相应中枢激活植物神经系统，易化交感神经的活动.有报道存在于中枢的AngⅡ参与应激时交感神经活性的调制［11］ .Jezova等［12］ 通过受体拮抗剂进一步证明脑内AngⅡ对应激时交感神经的兴奋、神经内分泌反应有重要作用.因此应激时下丘脑局部RAS的激活对易化交感神经活动起加强作用.下丘脑又是神经内分泌的枢纽，其分泌的CRH在应激反应中发挥关键作用.而研究报道［12，13］ ，AngⅡ可诱导CRH的释放，进而刺激ACTH的分泌，并可通过VP间接地刺激CRH与ACTH的分泌.本实验中应激时下丘脑无论是AngⅡ含量还是Ang mRNA表达变化都十分明显，尤其是Ang mRNA变化最突出，其Ang mRNA阳性细胞颗粒所占面积百分比比对照增强十几倍，由此可见，应激时下丘脑局部RAS的激活同样对下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴激素系统有激活作用.因此本 实验下丘脑Ang mRNA表达显著增强的结果，再一次证实了中枢RAS在应激反应中的重要意义.
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