作者：曲建波 张惠中 马保安 范清宇 张正旭
【关键词】 成骨肉瘤，
关键词: Stathmin;原位杂交;成骨肉瘤
摘 要:目的 明确stathmin基因在人成骨肉瘤组织有高表达并对其进行组织学定位. 方法 用地高辛标记全长stath-min基因，原位杂交方法检测stathmin基因在45例人成骨肉瘤组织及10例正常组织中的表达情况. 结果 在45例成骨肉瘤组织中有24例stathmin基因呈阳性表达（阳性率53%），阳性颗粒可见于胞质及胞核;10例正常组织中2例呈弱阳性表达，差异显著（P&<0.05）. 结论 Stathmin基因在骨肉瘤中的高表达与骨肉瘤的发生、发展有重要的相关性，该基因有望成为人成骨肉瘤生物治疗中的重要靶基因.
Keywords:stathmin;in situ hybridization;osteosarcoma
Abstract:AIM To observe over expression of stathmin gene and its localization in the tissue of osteosarcoma.METHODS The over expression of the stathmin gene was determined in45osteosarcoma specimens by in situ hybridiza-tion with Digoxigenin labled full length stathmin gene which were amplified from K562cells by RT-PCR method.RESULTS Over expression of stathmin gene was observed in24cases of osteosarcoma tissue（positive rate，53%）and positive signal was observed in both cytoplasm and nuclear.Among10cases of normal tissue，only2showed weak posi-tive signal.There was significant difference in expression of stathmin gene between osteosarcoma tissue and nomal tissue.CONCLUSION Over expreesion of stathmin gene may play a key role in the pathogenisis and development of osteosarco-ma.It may be a very important biotherapy target in the treat-ment of osteosarcoma.
0 引言
成骨肉瘤（osteosarcoma）是常见的恶性程度极高的骨源性肿瘤，5a存活率不足20%［1］ .Stathmin（又称Op18，p19，Prosolin及Metablostin）.是从淋巴瘤中筛选出的特征性表达基因［2］ ，我们应用RT-PCR方法首次在人成骨肉瘤SOSP-9607细胞系［3］ 中检测到stathmin基因高表达.我们应用地高辛标记的全长stathmin基因为探针，原位杂交（in situ hy-bridization，ISH）方法检测其在多种成骨肉瘤组织中表达情况.
1 材料和方法
1.1 材料 本研究所手术取骨肉瘤组织标本45（男33，女12）例，年龄8～43岁，另选正常组织标本10例.标本经40g・L-1 甲醛固定，石蜡包埋，厚5μm连续切片，病理确诊，骨母细胞型18例，软骨母细胞型13例，纤维母细胞型14例.
1.2 方法 全长stathmin基因的RT-PCR扩增:Trizol法提取K562细胞总RNA，反转录合成cDNA第一链（Gibico公司反转录试剂盒及说明），常规PCR扩增stathmin基因，所用引物如下（合成于上海博亚生物技术公司）:上游引物:5’-CAT ATG GCT TCT TCT GAT ATC CAG-3’;下游引物:5’-CTC GAG TTA GTC AGC TTC AGT CTC GTC-3’.PCR反应体系为:模板cDNA5μL，10×PCR缓冲液5μL，10mmol・L-1 dNTP2μL，10nmol・L-1-1 引物5μL及Taq DNA聚合酶1μL，加水至50μL，于94℃30s，58℃30s，72℃40s，反应35个循环.采用15g・L-1 低溶点琼脂糖凝胶电泳分离并回收PCR产物中480bp条带（Fig1）.探针标记:Digoxigenin标记盒购于德国Boehriger Mannheim公司，标记过程按说明书进行.所用杂交试剂为博士德公司试剂盒，杂交步骤按说明书进行.切片常规脱蜡至水，加5mL・L-1 过氧化氢甲醇液封闭内源性过氧化物酶，胃蛋白酶消化暴露核酸，每块组织切片分别滴加20μL杂交液（10mg・L-1 ）杂交过夜，滴加封闭液，加鼠抗地高辛抗体，分别滴加生物素化的羊抗鼠二抗和ABC复合物后DAB显色.常规脱水、透明、封片.对照实验分别用已知阳性的K562细胞甩片同步染色作为阳性对照;以PBS液替代抗地高辛抗体作为阴性对照.阳性对照为阳性，阴性对照为阴性.以细胞质或胞核呈棕黄色为阳性细胞，每例切片均至少观察5个具有代表性的高倍视野.
统计学处理:以SVSTA统计软件进行χ2 检验.
2 结果
在骨肉瘤45例标本中24例stathmin基因呈过表达，阳性率53%，10例正常组织中仅2例呈弱阳性反应，阳性颗粒可见于胞质及胞核（Fig1，2）.Stath-min基因在人成骨肉瘤组织和正常组织中的表达存在显著性差异（
Tab1，P&<0.05）.Stathmin基因在不同病理类型成骨肉瘤中的阳性表达率无显著差异（P&>0.05，Fig3）.
图2 －图3 略
表1 不同病理类型成骨肉瘤组织中stathmin基因的表达 略
3 讨论
微管相关蛋白（microtubule-associated pro-teins，MAPs）通过磷酸化和去磷酸化直接与MT结合调整其功能行为.MAPs磷酸化过程是在不同蛋白激酶作用下实现的，stathmin是这一过程中的重要调节因子［4］ ，是一种高度保守的细胞内蛋白，细胞周期过程中在胞外信号的介导下被蛋白激酶磷酸化.因此，抑制stathmin活性对细胞纺垂体形成至关重要，从而起到抑制细胞生长作用［5］ .骨肉瘤中存在多种癌基因及抑癌基因的改变已被众多研究所证实，但至今未见成骨肉瘤中有关stathmin基因表达异常的报道.我们首次应用RT-PCR证实了stathmin基因在成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中有高表达的基础上，进一步应用原位杂交方法检测了成骨肉瘤组织标本中该基因表达情况，结果显示在成骨肉瘤组织中该基因有较高的阳性表达率.提示部分成骨肉瘤的发生、发展可能与该基因表达异常有关.
目前，临床肿瘤治疗中所用化疗药很多为通过干扰微管及微管蛋白之间动力平衡系统发挥抗肿瘤作用.联合应用意义更大.应用反义核酸抑制stath-min表达与化疗药物为同一分裂途经上不同位点的作用，因此可起到协同抗肿瘤效应.这一模式在乳腺癌治疗中已成功应用并收到良好的效果.我们研究结果可为今后骨肿瘤临床治疗药物选择提供理论依据.
参考文献:
［1］Fan QY.Current concepts and principples of treat for tumor of muscu-skeletal system ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（12）:1013-1016.
［2］Zhong JS，Nelson M，Wang L.Indentification and chromosomal localizition of CTNNALI，a novel protein homoloous to alpha-catenin ［J］.Genmics，1998;54:149-154.
［3］Yang DT，Fan QY，Zhang DZ.Establishing and characterizing a human osteosarcoma cell ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（3）:264.
［4］Segerman B，Laarsson N，Mutational Analysis of Op18/Stath-min-Tubulin-interacting surfaces ［J］.J Biol Chem，2000;275:35759-35766.
［5］Wallon G，Rappsilber J，Mann M.Model for stathmin/Op18binding to tubulin ［J］.EMBO，2000;19（2）:213-222.