关于肝细胞肝癌中C2基因表达与HBxAg的关系

　　　　　　 作者：张庆　刘杰　李青　李勤　王新　乔泰东 樊代明

【关键词】 肝肿瘤
　　关键词: 肝肿瘤;肝炎抗原;C2基因
　　
　　摘 要:目的 研究蛋白翻译起始因子C2在肝硬化（LC）、原发性肝细胞癌（HCC）中表达的意义，并探讨其与HBxAg表达的关系. 方法 用免疫组化方法检测C2，HBxAg在肝硬化（n=27），HCC（n=60）中蛋白水平的表达.Western blot法检测C2蛋白在HCC及其癌旁组织中的表达. 结果 在27例LC中，C2蛋白阳性率为77.8%（21/27），HBxAg阳性率为74.1%（20/27）.60例HCC及42例癌旁组织中，C2蛋白阳性率分别占27.3%（17/60）和83.3%（35/42）.在HBxAg阳性的49例HCC中，10例C2蛋白阳性，阳性率为20.4%，在HBx-Ag阴性11例HCC中，7例C2蛋白阳性，阳性率63.6%.C2蛋白在LC中的表达明显高于HCC（P&<0.01），C2蛋白在HCC癌旁组织中表达明显高于癌组织（P&<0.01）;C2在HBxAg阳性HCC中表达明显低于HBxAg阴性HCC（P&<0.05）.Western blot与免疫组化结果一致. 结论 C2蛋白表达下调及HBxAg对C2的抑制作用可能与HCC发生发展有关.
　　
　　Keywords:liver neoplasms;hepatitis antigens;C2gene
　　
　　Abstract:AIM To study the expression significance of pro-tein translation initiation factor C2and its correlationship with expression of HBxAg in liver cirrhosis（LC）and hepato-cellular carcinoma tissues（HCC）.METHODS ABC im-munohistochemical method was used to detect the expression of C2protein and HBxAg in27samples LC，60samples of HCC and42samples of pericancerous tissue.Western blot method was used to detect the expression of C2protein in HCC tissue and pericancerous tissue.RESULTS In27sam-ples of LC，the positive rate of C2protein was77.8%and the positive rate of HBxAg was74.1%.In60samples of HCC and42samples of pericancerous tissue，the positive rate of C2protein was27.3%and83.3%，respectively.Ten samples and7samples were positive for C2protein in49sam-ples and11samples of HCC in which HBxAg was positive and negative，respectively.Statistical analysis suggested that the positive rate of C2protein was significantly higher in peri-cancerous tissue and LC than that in HCC（P&<0.01）.The positive rate of C2protein was significantly lower in HBxAg（+）tissue than that in HBxAg（-）tissue（P&<0.05）.Re-sult of Western blot method was consistent with that of im-munohistochemical method.CONCLUSION Low expression of C2protein and the suppression of C2by HBxAg may play an important role in the development of HCC.
　　
　　0 引言
　　
　　肝癌（HCC）是危害人类健康的常见的恶性肿瘤之一.我国是HCC高发区，也是HBV感染率较高的国家［1，2］ .HBxAg因能改变和调节某些转录因子的活性及信号转导途径，在转录调节水平上介导肿瘤形成，是HBV感染导致HCC的重要因子.多种基因的突变与HCC的发生密切相关［3-5］ ，其机制不明.蛋白翻译起始因子和肿瘤的关系日益受到重视，尤其是真核蛋白翻译起始因子（eukaryotic translation initi-ation factor1，eIF1）.C2是刚刚被克隆的人的eIF1全长cDNA序列［6］ ，我们利用最新制备的抗C2（eIF1）抗体，进行免疫组化及Western blot法，检测C2（eIF1）在肝硬化（LC），HCC中蛋白水平的表达，并观察HBV感染与C2表达之间的关系，以探讨C2在HCC发生中的作用.eIF1在LC，HCC中蛋白水平的表达情况.
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 病理证实肝细胞肝癌60例及肝硬化27例，为西京医院和陕西省肿瘤医院1996/2000外科手术切除标本.其中HCC标本42例带有癌旁组织;男52例，女8例;年龄≤50岁37例，&>50岁23例;根据TNM分级，Ⅰ级7例，Ⅱ级22例，Ⅲ级26例，Ⅳ级5例.选自术前未经放疗、化疗，无坏死的肿瘤组织，经40g L-1 甲醛固定，脱水，常规石蜡包埋，制备5μm厚连续切片.免抗C2多克隆抗体及免抗HBxAg多克隆抗体由美国费城Thomas Jefferson大学Prof.Feit-elson提供.SABC试剂盒购自武汉博士德公司.
　　
　　1.2 方法 石蜡切片常规脱蜡至水，30mL L-1 双氧水15min，以阻断内源性过氧化物酶活性，1g L-1 蛋白酶消化5min，100mL L-1 正常羊血清封闭40min，其余步骤按SABC试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木精复染.对照实验:免疫组化用已知HBxAg阴性的正常肝组织作阳性对照;以PBS缓冲液及正常免疫前血清代替一抗作空白阴性对照.Western blot法:用HCC及其癌旁新鲜手术标本提取蛋白，取等量的蛋白质做聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸纤维素膜转印后，用免抗C2多克隆抗体做Western blot分析.结果判定:显微镜下选取染色结果较理想部，于高倍镜下，每视野统计200个细胞数.阴性（-）:阳性细胞数比率&<10%;弱阳性（+）:阳性细胞数比率&>10%;阳性（）:阳性细胞数比率&>50%;强阳性（）:阳性细胞数比率&>75%，且染色呈深褐色颗粒.
　　
　　统计学处理:采用χ2 检验及Fisher精确法.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 C2蛋白的表达 在HCC及其癌旁肝组织内C2蛋白阳性信号为棕黄色颗粒状，主要位于胞质，HCC癌旁肝组织内阳性细胞数及阳性反应强度均比癌组织内高，阳性细胞以弥漫型分布为主（Fig1）.在HCC60例中，C2蛋白阳性17例，占27.3%;42例HCC癌旁组织中，C2蛋白阳性35例，占83.3%（Tab1）.在LC上C2蛋白阳性信号为棕黄色颗粒状，主要位于胞质;阳性细胞以弥漫型分布为主，少数病例呈局灶性（Fig2）.27例LC中C2蛋白阳性21例，占77.8%.阳性对照为阳性，阴性、空白对照为阴性.χ2 检验表明，C2蛋白在HCC组织中的阳性率明显低于其癌旁组 织及LC组织（P&<0.01）.Western blot结果显示，C2蛋白Mr 13000，其在HCC癌旁中的表达明显高于癌组织（Fig3）.
　　
　　图1 － 图3 略
　　
　　2.2 HBxAg表达与C2蛋白表达的关系 在HCC上HBxAg阳性信号为棕黄色颗粒状，阳性表达主要位于胞质，少数位于核内/核膜上，阳性细胞多呈弥漫型分布，少数病例呈局灶性（Fig4）.在HCC60例中，HBxAg阳性49例（81.7%）.在HBxAg阳性的49例HCC中，10例阳性（20.4%）;在HBxAg阴性的11例HCC中，7例阳性（63.6%）.在27例LC中，HBxAg阳性19例（70.4%）.在HBxAg阳性的19例HCC中，15例C2蛋白阳性（78.9%）;在HBxAg阴性的8例HCC中，6例C2蛋白阳性（75.0%）.χ2 检验表明，C2蛋白在HBxAg阳性HCC组织中的表达明显低于HBxAg阴性HCC组织（P&<0.05）;而C2蛋白在HBxAg阳性及HBxAg阴性LC组织中的表达无显著差异（P&>0.05）.
　　
　　表1 C2蛋白在肝组织中的表达　略
　　
　　图4 略
　　
　　3 讨论
　　
　　Liu等［6］ 在研究HCC时，将HBVX基因和氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）分别转入肝纤维母细胞HepG2，发现一基因因HBx而表达下调，后进一步克隆出了其全长基因序列，命名为C2，并制备了抗体.C2全长为1.3kb，是人的蛋白翻译起始因子eIF1的全长基因序列.因而eIF1的全长基因序列首次被克隆，使对其进一步功能研究成为可能.Liu等［6］ 对C2初步功能研究发现，C2可抑制细胞生长.我们的研究结果表明，C2蛋白在HCC组织中的表达明显低于其癌旁组织及LC组织，提示C2蛋白表达下调可能与HCC发生有关.Western blot结果显示C2蛋白Mr 约为13000，其在HCC癌旁组织中的表达明显高于癌组织.这进一步证实C2蛋白表达减低可能与HCC的发生发展密切相关.

　HBxAg与HCC发病密切相关.HBxAg可使 HBV干扰宿主细胞的生化代谢，影响细胞基因的正常表达而诱发HCC.HBxAg是一个转录激活蛋白，不能直接与DNA结合，其生物学活性均是通过蛋白-蛋白的相互结合而发挥作用，其反式激活作用具有非特异性，广谱性;HBxAg的反式激活活性显示出细胞特异性而非种族特异性，在HCC的发生、发展中起重要作用.如野生型p53对细胞生长起负调控作用，可防止恶性肿瘤的发生.p53基因功能失活与许多肿瘤发生有关［7-10］ .Liu等［6］ 发现，C2功能可被HBxAg所抑制.本结果显示:C2蛋白在HBxAg阳性HCC组织中的表达明显低于HBxAg阴性HCC组织，这进一步证实HBxAg对C2具有抑制作用，C2表达下调与HBV感染有关.提示HBxAg可能通过其反式激活作用与C2结合成复合物，导致C2功能丧失，从而刺激细胞生长，促进框架转移，导致细胞恶性转化，在翻译水平上诱发HCC.而在本实验的LC组中，C2蛋白在HBxAg阳性及HBxAg阴性组中的表达无显著差异，这进一步说明HBxAg对C2的抑制作用可能与HCC的发生密切相关.此外，我们的研究结果还显示:在60例HCC中，HBxAg阳性49例，阳性率为81.7%.这也和乙肝临床流行病学调查结果相附，即大多数肝癌患者均有多年的HBV感染病史［11］ .原因可能是在慢性感染的早期阶段，HBxAg被分泌到血清中而细胞中HBxAg很少.细胞中低水平游离的HBxAg使肝细胞停滞于细胞周期G1期，以利于病毒复制.此外，在慢性活动性肝炎及LC阶段，HBxAg主要定位于肝细胞胞质中，影响细胞多种信号传导途径，从而促进细胞恶变.
　　

参考文献

　　
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