【关键词】 骨肉瘤
关键词: 骨肉瘤;差异表达基因;反转录PCR技术;基因表达
摘 要:目的 筛选数个在人骨肉瘤中检出率高的差异表达基因片段并探讨其临床意义. 方法 以筛选出的5个新基因片段作为研究对象，采用RT-PCR技术检测37例骨肉瘤、68例其他骨肿瘤及19例截除肢体上的正常骨组织标本. 结果 在37例骨肉瘤中，表达检出率高的5个片段依次为:ZOL03为92.6%，1C82为89.4%，1C74为73.9%，2G12为66.5%，2A21为53.7%;在23例骨软骨瘤中表达率依次为:ZOL03为6.5%，1C82为14.7%，1C74为8.3%，2G12为11.9%，2A21为12.2%;在29例骨巨细胞瘤中表达率依次为:ZOL03为8.3%，1C82为15.6%，1C74为12.5%，2G12为13.8%，2A21为5.4%;在16例软骨肉瘤中表达率依次为:ZOL03为9.4%，1C82为14.3%，1C74为7.5%，2G12为6.8%，2A21为6.2%;在19例正常骨组织标本中表达率依次为:ZOL03为0，1C82为6.4%，1C74为0，2G12为4.8%，2A21为3.9%;这5个基因片段检出率在骨肉瘤与其他骨肿瘤中存在显著差异（P&<0.01）;其检出率在骨肉瘤与正常骨组织中存在显著差异（P&<0.01）. 结论 ZOL03，1C82，1C74，2G12及2A21这5个基因片段可能与骨肉瘤的发生、发展有关，监测骨组织中此5个基因片段的表达水平的变化可能对骨肉瘤的早期发现更有意义.
Keywords:osteosarcoma;differential expressed gene;RT-PCR;gene expression
Abstract:AIM To screen several genes differentially ex-pressed in human osteosarcoma with higher examination rates and discuss its clinical significance.METHODS By using ZOL03，1C82，1C74，2G12and2A21as research targets，37specimens of human osteosarcoma and68specimens of other musculoskeletal tumors as well as19specimens were screened by quantitative RT-PCR.RESULTS In37speci-mens of osteosarcoma，percentages of the5fragments with higher examination rate were92.6%（ZOL03），89.4%（1C82），73.9%（1C74），66.5%（2G12）and53.7%（2A21）sequentially.In23specimens of osteochondroma，percent-ages of the5fragments with higher examination rate were6.5%（ZOL03），14.7%（1C82），8.3%（1C74），11.9%（2G12）and12.2%（2A21）respectively.In29specimens of giant cell tumor of bone，the percentages of the5fragments in turn were8.3%（ZOL03），15.6%（1C82），12.5%（1C74），13.8%（2G12）and5.4%（2A21）.In16specimens of chondrosarcoma，the percentages in succession were9.4%（ZOL03），14.3%（1C82），7.5%（1C74），6.8%（2G12）and6.2%（2A21）.The expression rates of the5fragments between osteosarcoma and other musculoskeletal tumors were significantly different（P&<0.01）.And in19specimens of normal bone tissue，the expression rates of the5frag-ments were0（ZOL03），6.4%（1C82），0（1C74），4.8%（2G12）and3.9%（2A21）.The expression rates of the5fragments between osteosarcoma and normal bone tissue were significantly different（P&<0.01）.CONCLUSION The5fragments of differentially expressed genes isolated from hu-man osteosarcoma tissue may be correlated with occurrence and progress of osteosarcoma.
0 引言
骨肉瘤单纯手术治疗后复发率较高.ZOL03，1C82，1C74，2G12及2A21是我们采用差异展示PCR（DD-PCR）技术从人骨肉瘤组织与正常骨组织之间筛选出的差异表达基因片段，通过对收集的骨肉瘤、其他骨肿瘤及正常骨组织标本进行定量RT-PCR检测，拟筛选出在骨肉瘤组织中检出率高的差异表达基因片段，为建立骨肉瘤的基因诊断方法打下基
1 材料和方法
1.1 材料 ①标本:骨肉瘤手术标本37例;其他骨肿瘤手术标本68例，其中23例为骨软骨瘤，29例为骨巨细胞瘤，16例为软骨肉瘤;截除肢体上的正常骨组织标本19例.所有标本均采集于唐都医院全军骨科中心/全军骨肿瘤研究所，所有标本均经病理HE染色确诊.②引物:PCR引物由苏海川博士与李丁硕士共同设计，上海生物工程公司合成.③试剂:MMLV反转录酶购自Promega公司，PE5700型PCR扩增仪由美国PE公司提供，其他试剂均由第四军医大学全军基因诊断技术研究所提供.
1.2 方法 所有标本获取后，立即投入液氮中保存.采用Promega公司PolyATtract○R System1000试剂盒快速提取标本组织中的mRNA，经紫外扫描定量后稀释成0.1g・L-1 ，立即进行mRNA反转录:以oligo（dT）18为起始引物，依次加入无RNase的三蒸水10.4μL，5×Buffer4.0μL，dNTP（250μmol・L-1 ）1.6μL，mRNA（0.1g・L-1 ）1.0μL，oligo（dT）18引物2.0μL;反应条件为:65℃5min，37℃60min，75℃5min，MMLV反转录酶（200mU・L-1 ）在37℃10min时加入.取反转录产物2μL作为模板，依次加入:10×PCR Buffer3μL，2.5mmol・L-1 dNTPs3μL，上游引物各1μL（10pmol），下游引物各1μL（10pmol），ddh3 O10μL，混合后加入2.5U Taq酶;PCR循环条件为:94℃36s，55℃1min，72℃35s，35个循环，最后在72℃条件下延伸7min.在同一条件下，每次PCR以β-actin作内对照，以克隆质粒作阳性对照.PCR产物进行10g・L-1 琼脂糖电泳20min后，在GQS-9600型基因定量分析系统中扫描摄入电泳图像后，对特征性条带进行吸光度扫描［2］ ，将产物吸光度/对照产物吸光度比值进行成对资料统计学处理.
2 结果
2.1 差异表达基因片段在骨肉瘤中表达 在37例骨肉瘤标本中，表达检出率高的5个基因片段依次为:ZOL03的高表达率为92.6%，1C82高表达率为89.4%，1C74高表达率为73.9%，2G12高表达率为66.5%，2A21高表达率为53.7%.总体来看，这5个基因片段在骨肉瘤组织中的表达率较高，它们的PCR扩增产物电泳结果如Fig1.
2.2 差异表达基因片段在其他骨肿瘤标本中表达 在23例骨软骨瘤中表达率依次为:ZOL03表达率为6.5%，1C82表达率为14.7%，1C74表达率为8.3%， 2G12表达率为11.9%，2A21表达率为12.2%.在29例骨巨细胞瘤中表达率依次为:ZOL03表达率为8.3%，1C82表达率为15.6%，1C74表达率为12.5%，2G12表达率为13.8%，2A21表达率为5.4%.在16例软骨肉瘤中表达率依次为:ZOL03表达率为9.4%，1C82表达率为14.3%，1C74表达率为7.5%，2G12表达率为6.8%，2A21表达率为6.2%.该5个差异表达基因片段在其他骨组织肿瘤中的表达率都较低. 图1 5个差异表达基因片段扩增产物电泳结果 略
2.3 差异表达基因片段在正常骨组织标本中表达 在19例正常骨组织标本中，5个基因片段的表达率依次为:ZOL03的表达率为0，1C82的表达率为6.4%，1C74的表达率为0，2G12的表达率为4.8%，2A21的表达率为3.9%.这5个差异表达基因片段在正常骨组织中的表达率都很低或不表达.
将产物吸光度/对照产物吸光度的比值进行统计学处理后，发现这5个基因片段检出率在骨肉瘤组织标本与其他骨肿瘤组织标本中存在显著差异（P&<0.01）;在骨肉瘤组织与正常骨组织中其检出率存在显著差异（P&<0.01）.因此，我们认为这5个差异基因片段是骨肉瘤高表达基因片段，可能与骨肉瘤的发生发展有关.
3 讨论
人们发现骨肉瘤与多种癌基因相关，且与抗癌基因的失活有关［2］ ，这些基因的改变以及表达的变化决定了骨肉瘤的生物学与临床行为;这些基因在骨肉瘤发生发展过程中出现的时间不同、变化不同、意义不同，多基因多表达的检测对于骨肉瘤的早期诊断、鉴别诊断以及恶性程度的判断均具有重要意义.目前已阐明了一些基因与骨肉瘤的发生、发展相关联［3-5］ .我们在以前的工作中，获得了123个骨肉瘤差异表达基因片段，从中找出了11个同源性很低的序列，其中2个序列被GenBank收录.我们根据所获得的序列设计了11对引物，运用定量PCR技术对收集的多个骨肉瘤组织标本进行了表达水平的检测，筛选出了表达水平高的5个基因片段;此5个基因片段在其他骨肿瘤标本及正常骨组织标本中的检出率很低，与在骨肉瘤组织标本中的表达率存在显著差异（P&<0.01），表明这5个差异表达基因片段可能与骨肉瘤的发生发展有关.
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