【关键词】 克隆
关键词: 酪氨酸酶相关蛋白-2;克隆;融合表达;白癜风
摘 要:目的 克隆酪氨酸酶相关蛋白-2（TRP-2）编码基因，表达TRP-2蛋白. 方法 从培养的人黑素细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR方法扩增TRP-2编码基因，克隆至pUC19载体并测序，再亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达TRP-2/GST融合蛋白. 结果 从培养的人黑素细胞中扩增出编码TRP-2的cDNA，序列测定证实与文献报道的序列一致;成功构建了GST融合表达载体pGEX-4T-1/TRP-2;表达了TRP-2/GST融合蛋白. 结论 成功克隆了人TRP-2基因，构建了GST融合表达载体并表达了TRP-2/GST融合蛋白.
Keywords:tyrosinase related protein-2;clone;fusion ex-pression;vitiligo
Abstract:AIM To clone the cDNA of human tyrosinase re-lated protein2（TRP-2）and express the corresponding pro┐tein.METHODS Total RNA was isolated from cultured hu-man pigmental cells and mRNA was reversly transcribed into cDNA.Then PCR was used to amplify the TRP-2coding re-gion.The PCR product was cloned into pUC19plasmid and sequenced，then subcloned into vector pGEX-4T-1.The TRP-2protein was expressed in E.coli of DH5αas fusion protein with glutathione S-transferase（GST）induced by IPTG.RESULTS TRP-2coding region was cloned into pUC19and the sequence was confirmed;Fusion expressing vector of pGEX-4T-1/TRP-2was successfully constructed;TRP-2/GST fusion protein was correctly expressed.CON┐CLUSION Human TRP-2gene is successfully cloned and TRP-2/GST fusion expressing vector is constructed.TRP-2/GST fusion protein is correctly expressed in E.coli.
0 引言
酪氨酸酶相关蛋白-2（tyrosinase related pro-tein-2，TRP-2）DHI-2羧酸转化过程中发挥作用.TRP-2是一种胞质抗原与白癜风的病理机制有关，在白癜风、恶性黑素瘤及接受特异性免疫治疗而产生色素减退的患者血清中抗TRP-2IgG滴度较高.此外，抗TRP-2自身抗体与TRP-2或酪氨酸酶均可发生反应，即TRP-2与酪氨酸酶为交叉抗原.因此，克隆并翻译TRP-2的cDNA序列，可为进一步探索酪氨酸酶与TRP-2的交叉抗原表位及白癜风的发病机制和治疗打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料 人黑素细胞系、克隆质粒pUC19、表达质粒pGEX-4T-1和菌株DH5α由第四军医大学西京医院皮肤科实验室保存;总RNA提取试剂盒购于华美公司;BamH I，EcoR I，T4DNA连接酶购于TaKaRa公司;Taq DNA聚合酶，反转录试剂盒、胶回收试剂盒购于Promega公司;谷胱甘肽巯基转移酶（GST）纯化试剂盒购于CloneTech公司.
1.2 方法 根据载体多克隆酶切位点及TRP-2的序列，设计引物.其中引物5’端中引入BamH I酶切位点，3’端引入EcoR I酶切位点.引物由北京SBS公司合成，引物的序列为（下划线为酶切位点）:p15’CG---GGATCC---ATGGGCTATAATTGT GGAGACTGCA3’p25’CG---GAATTC---GGCAAAGTTCCAGTA GGGCAAA3’;
按试剂盒说明书方法操作，从培养的人黑素细胞中提取总RNA，将mRNA反转录合成cDNA.目的基因片段常规PCR扩增，反应条件为:95℃预变性2min后加入Taq DNA聚合酶1U，按94℃30s，55℃30s，72℃40s，进行35个循环，最后在72℃延伸10min.以HPV重组质粒为反应体系的阳性对照，三蒸水为空白对照，以TRP-1重组质粒为阴性对照.PCR产物进行12g・L-1 琼脂糖电泳，检测扩增产物片段的大小.产物经回收后，以BamH I，EcoR I双酶切，回收目的片段后定向插入经同样双酶切的pUC19载体中，以T4DNA连接酶连接.重组后的质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，提取质粒后以BamH I，EcoR I双酶切，12g・L-1 琼脂糖电泳鉴定.重组质粒由上海生工生物工程公司完成测序.目的基因片段的亚克隆:将测序后的重组载体以BamH I，EcoR I双酶切，切下的片段插入经同样双酶切的pGEX4T-1载体中，转化感受态细胞DH5α.TRP-2与GST融合蛋白的诱导表达:加入终浓度为0.4mmol・L-1 的IPTG，于37℃分别诱导培养2，3和4h，按常规方法收菌，进行SDS-PAGE.用薄层扫描仪分析该蛋白占菌体总蛋白的含量［1］ .表达蛋白的可溶性鉴定:以超声波破碎细胞，收集表达菌体后，分别取相同浓度的50μL上清及沉淀，进行SDS-PAGE，观察表达条带是在上清中还是在包涵体中.表达蛋白的纯化用Clotech公司的GST融合蛋白纯化柱，按操作说明操作. 转贴于 2 结果
2.1 TRP┐2基因的克隆及测序 12g・L-1 琼脂糖凝胶电泳显示，扩增出1条核酸片段，与预计的大小（457bp）基本一致（Fig1）.TRP-2基因的扩增片段纯化后与pUC19载体连接，经BamH I和EcoR I双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示切出大小约447bp的重组片段（Fig2），表明系阳性克隆.测序结果与已知序列完全一致.
2.2 TRP┐2/GST融合表达载体的构建 GST融合表达载体的构建通过粘端的亚克隆进行［2］ ，克隆质粒pUC19/TRP-2经BamH I和EcoR I双酶切后，释放447bp片段，将此片段与BamH I和EcoR I双酶切线性化的原核表达载体pGEX-4T-1连接.转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，构建的重组质粒经BamH I 和EcoR I双酶切，释放447bp片段（Fig3），GST融合表达载体的pGEX-4T-1/TRP-2构建成功.
图1 － 图4 略
pGEX-4T-1/TRP-2/DH5α在37℃振荡培养至A600 值为0.4，分别诱导2，3和4h.经SDS-PAGE，比较诱导前后蛋白表达情况，发现Mr 为43000的蛋白在诱导2h后即有相当量的表达，诱导4h后表达量趋于稳定，诱导时间的增加仅引起细菌浓度的缓慢增加.诱导培养后的工程菌以超声破碎法裂解，表达的融合蛋白以可溶性的形式存在于大肠杆菌中，菌体裂解液经谷氨酰胺树脂纯化试剂盒纯化［3］ ，100g・L-1 SDS-PAGE显示已得到较高纯度的蛋白质（Fig5）.
3 讨论
白癜风患者血清中存在抗黑素细胞抗体滴度与病情活动性相关［4］ .另外，白癜风患者的血清在体外通过抗体介导的细胞毒作用可以杀伤人黑素细胞［5］ ，表明抗黑素细胞抗体可能参与了白癜风的发病.利用白癜风患者血清中的自身抗体，使几种白癜风相关的黑素细胞抗原已得以明确，其中3种胞质抗原酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1（TRP-1）［6］ 、酪氨酸酶相关蛋白-2（TRP-2）表现为40%的同源性，构成了酪氨酸酶相关蛋白家族.TRP-2基因是一种胞质抗原.
抗TRP-2自身抗体与TRP-2或酪氨酸酶均可发生 反应，即TRP-2与酪氨酸酶存在交叉抗原.
图5 略
我们研究选取编码TRP-2的一段438bp的基因序列（721～1158bp）-该序列与酪氨酸酶基因有80%同源性，已知的酪氨酸酶抗原表位（氨基酸289～294和295～300）编码区在本序列中;其编码的蛋白由146个氨基酸组成，M
r 约为16990.我们从培养的人黑素细胞中提取总RNA进行RT-PCR及特异扩增，获得了人TRP-2基因的一段编码区序列，经序列分析证实，与GeneBank报道的人TRP-2基因中相应区域完全一致［7，8］ .为使融合基因得到高效及稳定的表达和考虑到用原核细胞表达真核蛋白的特性，我们构建了GST融合表达载体pGEX-4T-1/TRP-2.根据表达载体的特性，用IPTG去除lac的阻遏作用，使TRP-2在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达，为进一步研究TRP-2的抗原表位、白癜风的发病机制和治疗奠定了实验基础.
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