【关键词】 小肠移植
关键词: 小肠移植;他罗利姆;移植物排斥;免疫抑制
摘 要:目的 观察大鼠小肠移植术后应用普乐可复（FK506）对小肠移植排斥反应的免疫抑制作用. 方法 选用近交系大鼠F344/N（RTⅠ1 ）和Wistar大鼠进行全小肠异位移植，实验分4组.第1组，异基因移植组F344/N-Wistar;第2组，小剂量普乐可复治疗组F344/N-Wistar+FK506（0.2mg・kg-1 ・d-1 ，0～14d，im）;第3组，普乐可复治疗组F344/N-Wistar+FK506（0.5mg・kg-1 ・d-1 ，0～14d，im）;第4组，同基因移植组（F344/N-F344/N）.观察大鼠的一般状况及存活时间并于术后第3，5，7日取移植小肠标本进行病理学检查和比较. 结果 第1组大鼠存活时间与其他3组有显著差异（P&<0.01），第1组大鼠在术后第3，5，7日病理学检查移植肠出现排斥反应，而第2，3，4组无明显排斥，可长期存活. 结论 普乐可复能明显抑制小肠移植急性排斥反应的产生，显著地延长移植物存活时间.
Keywords:small bowel transplantation;tacrolimus;trans-plant rejection;immunosuppression
Abstract:AIM To observe the immunosuppression of FK506on the transplant rejection after small bowel trans-plantation in rats.METHODS Heterotopic small bowel transplants was carried out between inbred F344/N and Wis-tar rats.The recipients were pided into four groups，groupⅠ，F344/N-wistar;groupⅡ，F344/N-wistar+FK506（0.2mg・kg-1 ・d-1 ，0～14d，im）;groupⅢ，F344/N-wistar+FK506（0.5mg・kg-1 ・d-1 ，0～14d，im）;groupIV，F344/N-F344/N.Post transplant clinical course and survial dura-tion were recorded and the grafts were harvested on post-op-erative day3，5，7.All samples were examined pathological-ly and compared with each other.RESULTS The survial duration of groupⅠwas significantly different from that of the other tree groups.The pathological examination of the transplantated bowel specimen from groupⅠshowed that the transplant rejection on post-operative day3，5and7while none of groupⅡ，ⅢandⅣhad pathological evidence of transplant rejection.CONCLUSION FK506could obvi-ously suppress the transplant rejection in small bowel trans-plantation in rats and significantly prolong the survial dura-tion.
0 引言
小肠移植被视为治疗终末期肠功能衰竭的唯一确切的方法，而小肠属于高免疫原性器官，含有丰富的淋巴组织，与其他器官移植相比，小肠移植排斥反应尤为严重，也是小肠移植失败的主要原因［1］ ，皮质类固醇激素，硫唑嘌呤，环孢霉素A等免疫抑制剂对于小肠移植排斥反应效果不理想，且本身具有较大的毒副作用，因此寻找新型的高效免疫抑制药物十分必要.普乐可复（FK506）是一种新型的免疫抑制药物，其免疫抑制作用较环孢霉素A强10～100倍［2］ ，我们采用大鼠小肠移植动物模型，研究FK506对小肠移植排斥反应的免疫抑制作用.
1 材料和方法
1.1 材料 选用体质量在280～320g雄性近交系F344/N（RTⅠ1 ）及Wistar大鼠（均由北京医科大学实验动物中心提供）随机分为4组，每组24只大鼠，分组如下:第1组，异基因移植组F344/N-Wistar;第2组，小剂量普乐可复治疗组F344/N-Wistar+FK506（0.2mg・kg-1 ・d-1 ，0～14d，im）;第3组，普乐可复治疗组F344/N-Wistar+FK506（0.5mg・kg-1 ・d-1 ，0～14d，im）;第4组，同基因移植组（F344/N-F344/N）.
1.2 方法
1.2.1 动物模型制作 小肠移植方法采用异位全小肠移植术［3］ 并加以改进.动物在术前禁食24h，饲以50g・L-1 葡萄糖盐液.氯胺酮按100mg・kg-1 ip麻醉，供体手术:腹部中线纵形切口入腹后，首先行全结肠切除术，于距屈氏韧带2cm和距回盲部2cm处切断空肠和回肠，分离出门静脉，尽量剥净周围胰腺组织，结扎右肾动脉及腰动脉，游离带肠系膜动脉的一段腹主动脉，结扎已分离的腹主动脉近心端，用1cm硅胶管插入腹主动脉后，用4℃肝素化乳酸林格液（50U・mL-1 肝素钠）约5～10mL，于40cm高度灌洗移植肠段至肠管颜色苍白，于肝门处离断门静脉，将移植肠取下放入4℃乳酸林格液中保存，灌洗的同时将5F内径cuff管套入门静脉，翻转门静脉使其内膜向外翻于套管上，6-0丝线结扎固定.受体手术:受体与供体同样麻醉开腹后，游离左肾静脉，于肾门处结扎，切除左肾，显露左肾动脉下方腹主动脉约1.5cm，在其上、下方阻断血流，9-0无损伤线行供肠带肠系膜上动脉的腹主动脉与受体的腹主动脉行端侧吻合，静脉吻合时，先阻断左肾静脉的起始部，牵引肾门结扎线，并剪除，充分显露左肾静脉断端，遂将带cuff套管的门静脉端插入左肾静脉，结扎固定，去除阻断动、静脉的显微外科止血夹，即见肠系膜上动脉搏动明显，移植肠肠管红润，遂将供肠理顺并行移植肠近端结扎，远端左侧腹壁造瘘，甲硝唑冲洗后逐层关腹，受体移植后经阴茎静脉给予2～3mL平衡盐.
1.2.2 观察指标 大鼠手术当日给予50g・L-1 葡萄糖盐液，术后第1日开始给予自由进食水，观察大鼠精神状况，进食情况，肠造口排出液性质等，分别于术后3，5，7d，每组各处死6只，取出移植肠，行40g・L-1 甲醛液固定，常规石蜡包埋切片，厚约3μm，各组余下大鼠作移植小肠生存时间观察，存活至30d处死，结束实验.术后72h内死亡者为技术失败，不包括在统计范围之内.
1.2.3 组织病理学检查 各例切片作常规HE染色，显微镜观察，按排斥反应标准诊断排斥程度［4］ .轻度:肠粘膜绒毛数目减少，轻度增粗，变短，少量淋巴细胞和粒细胞浸润，少量凋亡上皮细胞;中度:肠粘膜绒毛明显变矮增宽，粘膜上皮开始脱落，细胞浸润加重，上皮细胞凋亡数目明显增多;重度:肠绒毛结构消失，上皮脱落，间质大量炎细胞浸润，肌层结构破坏，血管炎.
统计学处理:所有结果均以x ±s表示，并用 SPLM统计软件做样本分析.
2 结果
2.1 大体观察 各组大鼠术后苏醒较快，苏醒后即正常活动，第1组大鼠术后第2日即开始出现不同程度的嗜睡，厌食，毛发零乱，对外界反应下降，体质量减轻，直至死亡，剖腹探查观察移植肠颜色灰白，肠腔扩大并广泛粘连，逐渐加重，伴腹腔大量脓性渗出，严重的有移植肠穿孔.第4组大鼠精神好，进食正常，活动自如，腹壁造口精膜红润，分泌物粘稠，定期剖腹探查，移植肠红润，肠系膜血管搏动明显，移植肠粘连少.第2，3组大鼠精神好，对刺激反应灵敏，定期剖腹探查大鼠移植肠肉眼观察与第4组相似.
2.2 移植大鼠存活时间的观察 第1组大鼠小肠移植后平均存活时间为（7.3±1.1）d，所有大鼠都死于急性排斥反应及其所引起的腹膜炎.第2组大鼠存活时间为（18.7±1.7）d，4只大鼠死于急性排斥反应所引起的腹膜炎，2只大鼠死于肠梗阻.与第1组相比存活时间显著延长（P&<0.01）.第3组大鼠平均存活时间为（25.2±5.9）d，4只死于急性排斥反应及感染，2只大鼠存活超过30d，与第1，2组差异明显（P&<0.01），第4组大鼠平均存活时间为（28.3±2.3）d，1只大鼠死于腹膜炎，1只大鼠死于肠梗阻，4只大鼠存活超过30d，与第1，2组差异显著（P&<0.01），而与第3组无明显差异（P&>0.05）.
2.3 移植肠组织连续病理组织学检查结果 第1组大鼠术后3d病理学检查示肠粘膜下层间质中有少量淋巴细胞浸润，肠绒毛增粗，变短;术后5d大鼠移植肠粘膜淋巴细胞浸润增多，并累及固有层，肠粘膜上皮水肿，粘液细胞减少，肠绒毛顶端倒覆，符合轻度排斥反应标准（Fig1）;术后7d出现粘膜全层大量淋巴细胞浸润，肠绒毛少而低平，散在肠粘膜上皮脱落，表现中度排斥反应（Fig2）;尸检示终末期移植小肠粘膜破坏消失，肠壁变薄伴坏死，大量淋巴细胞浆细胞浸润肠壁全层，表现为重度排斥反应（Fig3），第2，3组3，5和7d大鼠病理改变未见排斥反应迹象，粘膜层亦可见少量淋巴细胞和浆细胞浸润（Fig4，5）.第4组大鼠术后无排斥反应病理现象，仅见间质有少量淋巴细胞浸润（Fig6）.
3 讨论
用F344大鼠与Wistar大鼠之间进行小肠移植，可以观察到典型的小肠移植排斥反应，并且其进展比较迅速，因此本实验选择这种异位全小肠移植模型并进行相应的干预措施，结果较为科学和肯定.
图1 －图6 略
小肠移植因其同时将属于免疫组织的肠系膜淋巴结和淋巴丛板进行移植，排斥反应和移植物抗宿主病（GVHD）更为强烈，因此过去小肠移植常因严重的排斥反应而导致移植失败［5，6］ ，直到FK506的发现，才使临床小肠移植成功成为可能.FK506是一种免疫亲和肽配体类药物，是迄今发现的最强有效的免疫抑制剂［7］ .FK506通过与T细胞胞质的FK506结合蛋白（FKBP）结合形成FK506/FKBP复合物，抑制T细胞活化的细胞内靶点，即Calcineurin，是一种Ca2+及钙调素依赖性蛋白磷酸酯酶，当FK506-FKBP复合物与Calcineurin结合后，再抑制Calcineurin的磷酸酯酶活性，使T细胞活化核因子的胞质亚基（NF-ATc）的核内转移受阻，抑制了IL-2有关的功能性转录因子的形成，从而抑制T细胞早期基因的活化，同时FK506可通过抑制NF-AT的脱磷酸化而抑制IL-2，IL-3，γ干扰素等细胞因子的产生和IL-2受体等细胞表面分子的表达，从而抑制T细胞的活化和免疫反应的产生［8］ .在本实验中，FK506在大鼠小肠移植中，发挥重要的免疫抑制作用，应用FK5060.2mg・kg-1 ・d-1 ，大鼠平均存活19d，应用FK5060.5mg・kg-1 ・d-1 ，大鼠平均存活25d，存活时间均比第1组明显延长，差异显著（P&<0.01）.这些现象表明FK506能明显抑制大鼠小肠移植急性排斥反应发生，延长受体存活时间. 转贴于 但在小肠移植过程中，免疫抑制剂的使用引起免疫抑制过度和免疫抑制不足之间的平衡十分微妙，感染性疾病是在许多由于过度免疫抑制而引起的疾病中最危险的，在匹兹堡大学移植中心，63例临床小肠移植中，35例患者移植小肠未能成活，大多数是由于感染引起（n=19），而FK506血药浓度过高是导致感染的最危险因素
［9］ .同时按照常规FK506治疗方案，42%小肠移植患者术后出现细菌移位［10］ ，经研究证实，大鼠小肠移植术后加FK506治疗剂量为1～2mg・kg-1 ・d-1 ，则细菌移位和感染发生的机率大大提高，但是免疫抑制不足则引起急性排斥反应最终导致细菌移位和感染而死亡，可见FK506在小肠移植中的合理应用显得非常关键.
在本实验中虽然FK506治疗组大鼠存活时间都明显延长，但第2组大鼠治疗过程中有1例在14d内即因急性排斥反应而致腹膜炎死亡，其余大鼠停药后短期内均由于急性排斥反应等各种并发症而死亡，而第3组大鼠存活时间明显提高，停药后仍可较长期存活.因此，0.2mg・kg-1 ・d-1 FK506治疗时，因免疫抑制不足而引起急性排斥反应导致腹膜炎死亡，有研究表明，小肠移植术后早期有效的高浓度免疫抑制剂的应用是防止急性排斥反应的关键［11］ ，第3组用0.5mg・kg1 ・d-1 FK506作为治疗剂量提供了满意的平衡，既可避免移植过程中免疫抑制不足及过度，又可保证FK506早期高水平血药浓度.
如本实验所示，FK506能明显抑制小肠移植排斥反应的发生，FK506在器官移植中是一种很有前途的免疫抑制剂，它在控制排斥反应，保证移植物功能，提高患者生存率等方面，较CsA和其他免疫抑制剂有较大优越性，并且具有低毒性、低感染率和对类固醇相对非依赖性等特点.FK506已广泛应用于肝脏、肾脏、心脏、肺和小肠移植中，都取得了良好的效果，就小肠移植而言结合国内外临床应用，采用以FK506为主的免疫抑制治疗具有很大的优越性［12］ ，随着对FK506长期应用效果的评价，更为合理的用 药方案的提出以及简便而有效的临床监测方法的建立等问题的进一步深入研究，将使FK506发挥越来越大的免疫抑制作用.
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