作者：刘勇红 万琪 张巍 李力 王洪典
【关键词】 局部缺血
关键词: 钙/分析;局部缺血;氟桂嗪
摘 要:目的 研究类缺血状态下神经元胞质内游离钙离子及细胞活性变化，探讨缺血性神经元的损伤与细胞内钙离子的关系及西比灵的治疗意义. 方法 利用Ca2+ 指示剂Flu-3/AM作为细胞内钙离子的荧光探针负载培养的神经元，共聚焦技术检测细胞内荧光强度的变化，利用四唑蓝（MTT）比色试验检测缺血性神经元的损伤程度. 结果 给予神经元类缺血处理10min后，缺血组神经元胞质内钙离子浓度和细胞损伤程度明显高于西比灵预处理组（P&<0.01）. 结论 西比灵可明显抑制神经元胞质内钙离子的升高，减轻由此引发的缺血性神经元的损伤程度.
Keywords:calcium/analysis;ischemia;flunarizine
Abstract:AIM To study the changes of intracellular Ca2+ and cell activity and protection of Sibelium on cortical neu-rons on ischemic-like condition.METHODS Neurons were cultured and loaded with Flu-3/AM，［Ca2+ ］I was measured by fluorescent intensity（FI）in each cell with confocal mi-croscopy，and the extent of neurons injury was analyzed with MTT reduction assay.RESULTS After10min ischemic-like conditioning，a rapid increase in fluorescence intensity was observed，there was obvious difference between ischemic group and Sibelium treatment group，the fluorescence inten-sity in ischemic group was higher than that in Sibelium treat-ment group（P&<0.01）.The A value of injured neurons in is-chemic group was significantly lower than that in therapy group（P&<0.01）.CONCLUSION Sibelium could reduce the increase of ［Ca2+ ］I in cortical neurons and the extent of the injured neurons after ischemic-like conditioning.
0 引言
近年来，细胞内钙离子持续升高介导的缺血性神经元损伤已成为研究者关注的焦点之一.目前认为缺血后神经元死亡主要与通过NMDA型谷氨酸受体-通道复合物的神经毒性和由此产生的钙离子通过电压依赖型钙通道进入神经元有关.Chung等［1］ 利用免疫组织化学方法发现，全脑缺血2～3d后，N-型Ca2+ 通道在缺血区表达增强.各种人工合成的钙通道拮抗剂相继用于临床治疗缺血性脑损伤并取得一定疗效，关于其作用机制却知之甚少.我们采用Flu-3/AM为钙离子指示剂，参照Mitani等［2］ 法建立培养神经元的类缺血模型，利用激光扫描共聚焦显微镜，监测缺血期间钙离子的变化并采用MTT比色试验检测缺血性神经元的损伤情况，观察钙通道拮抗剂西比灵（sibilium）对缺血神经元的影响，试图探讨钙离子与缺血性神经元损伤的内在关系及西比灵的作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 ①动物:孕15d昆明种二级鼠由第四军医大学实验动物中心提供（陕动字003号）.②主要试剂和仪器:胎牛血清由杭州四季青公司提供，DMEM由Gibco公司提供，胰酶由华美公司提供.CO2 培养箱由Sanyo公司提供.西比灵由西安杨森公司提供.
1.2 方法
1.2.1 激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿的处理 在直径50mm塑料培养皿中央钻一直径10mm的圆孔，将22mm2 的盖玻片用加拿大胶粘于孔底部，消毒后使用.
1.2.2 人工脑脊液的配制 其组成为（mmol L-1 ）:NaCl123，KCl3.75，Kh3 PO4 1.25，NaHCO3 26，MgCl
2 1，CaCl2 2，葡萄糖10，pH7.4.
1.2.3 细胞培养 将实验动物引臼脱颈处死，碘酒乙醇消毒腹部，逐层剖开皮肤、肌肉、腹膜取出胎鼠，仔细剥离胎膜羊膜，暴露胎鼠，体视显微镜下剥离脑膜，分离胎鼠大脑脑泡外侧部的皮质，剪碎脑组织，经含125mg L-1 的胰酶消化（37℃，15min），离心1000r min-1 ，10min，弃上清，200mL L-1 胎牛血清的DMEM（Gibco公司）终止消化，以完全培养基（10mL L-1 胎牛血清，青、链霉素1×105 U L-1 ）稀释至7×108 L
-1 密度并接种于经多聚赖氨酸（Sigma）处理过的专用培养皿和96孔板，送入50mL L-1 CO2 的培养箱（Sanyo公司），37℃，培养48h后，加入阿糖胞苷（5mg L-1 ）以抑制非神经元的继续生长，每隔2d半量换液，培养10d后，可见典型的神经元，经β-tubulin免疫荧光染色显示80%以上细胞为阳性，可认为是纯神经元培养，进行后续实验研究［3］ .
1.2.4 类缺血模型建立 细胞培养基换为不含糖的人工脑脊液，温度保持在（30±2）℃，混合气体换为含80mL L-1 CO2 的N2［4］ .
1.2.5 实验分组 将培养好的细胞分为:①缺血组，按类缺血模型处理10min.②治疗组，给予1μmol L-1 西比灵2min预处理后，类缺血处理10min.③对照组，给予含糖的人工脑脊液，混合气体为50mL L-1 CO2 的O2 ，10min后进行实验.
1.2.6 神经元胞质内［Ca+ ］的浓度测定 将培养皿内培养的细胞经PBS冲洗3次，于37℃条件下用Flu-o
-3/AM（终浓度10μmol L1 ，Bio-Rad公司）负载30min，PBS冲洗3次，将培养皿置于ACAS570载物台上，在激光共聚焦显微镜下动态扫描细胞内荧光强度变化，激发波长488nm，发射波长522nm，采样频率为488Hz，共聚焦系统由Bio-Rad公司MRC-1024提供的Time-Course/Ratiometric软件控制，每皿选2～3个视野，以平均荧光强度变化（ΔFI）反映胞质内游离钙离子浓度的相对水平［5，6］ .
1.2.7 MTT测定法 同样分为缺血组、对照组和西比灵组.向96孔板每孔加入MTT（华美公司，5g L-1 ）20μL，37℃继续培养4h，吸弃上清液，每孔加入150μL二甲亚砜（DMSO），振荡10min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪上测各孔A490nm 值.
统计学处理:数据经Pentrium90微机系统Time-Course/Ratiometric软件对图形及时间进行实时测量获得.采用ORIGIN6.0统计软件进行数据处理，以x ±s表示，组间差异显著性检测用方差分析法. P&<0.01，有统计学意义.
2 结果
2.1 类缺血处理后神经元内［Ca2+ ］的变化 经Fluo-3/AM标记后的神经元在ACAS570上观察，细胞边界模糊，突起细长，细胞内荧光强度分布不甚均匀，接近两侧突起处荧光强度较强（Fig1A）.细胞内荧光强度曲线迅速上升至峰值（Fig2A）.
2.2 西比灵对类缺血处理后神经元内［Ca2+ ］的变化 经西比灵处理过的神经元给予类缺血处理后，细胞边界尚清晰，细胞内荧光强度较类缺血组弱（Fig1B）.细胞内荧光强度曲线缓慢升高，其峰值低于类缺血组（Fig2B）.
2.3 MTT法观察西比灵对类缺血处理神经元活性的影响 缺血处理组与西比灵干预组相比，其A490nm 值显著性降低（P&<0.01，Tab1）.
表1 西比灵对缺血性神经元［Ca2+ ］i 和细胞活性的影响 略
3 讨论
根据动力学与电压依赖的特性，神经元钙离子通道可分为两类:一类是由轻度去极化激活后接下来失活称为低电压激活（LVA）电压依赖性钙离子通道;另一类是由高度去极化激活，称为高电压激活（HVA）钙离子通道.据其药理学特点，HVA型钙离子通道进一步分为L-，N-，P-，Q-和R-型钙离子通道［7］ .以往研究显示，西比灵对L-和N-型钙离子通道有阻断作用［8，9］ .我们发现，神经元经类缺血10min后，细胞内钙离子浓度快速上升，其上升的速度及幅度明显高于西比灵预处理组，说明西比灵确实为一种有效的钙通道拮抗剂，但它并未完全阻断类缺血状态下神经元胞质内钙离子升高，其可能的解释为:①西比灵仅作用于高电压激活的钙离子通道;②神经元胞质内钙离子的升高，其来源除细胞外钙离子内流，尚有细胞内钙池释放钙离子，西比灵对其是否有影响尚需探讨.
图2 略
本实验发现西比灵降低缺血性神经元胞质钙离子的同时，明显减轻缺血性神经元损伤程度.说明通过L-和N-型钙离子通道进入神经元的钙离子参与介导缺血性神经元损伤.关于钙离子介导缺血性神经元损伤的确切机制尚不清楚，细胞内钙离子升高时其钙离子的来源有细胞外钙离子内流和细胞内钙池释放钙离子，是否两者来源的钙离子均参与缺血性神经元的损伤及其所占比例以及二者的相互作用关系 均待研究.一些研究显示，内质网及其他相关的钙池释放的钙离子参与介导缺血性神经元的损伤［10，11］ .本实验发现西比灵并未完全抑制缺血性神经元的损伤，也说明参与缺血性神经元的损伤的钙离子其来源不仅为细胞外钙离子内流.
参考文献
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