作者：郑壬鸿 窦科峰 梁克明
【关键词】 细胞凋亡
关键词: 有丝分裂原激活的蛋白激酶家族;信号转导;细胞凋亡;顺铂;肝癌SMMC-7721细胞株;免疫细胞化学;流式细胞术
摘 要:目的 体外使用顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡，检测细胞转导因子MAPKs及转录因子（JUN，CREB）活性的变化. 方法 采用免疫细胞化学法和流式细胞术法. 结果 15mg L-1 顺铂作用肝癌SMMC-7721培养细胞48h可观察到明显的凋亡峰，72h免疫细胞化学染色发现胞质或（和）胞核中MAPKs（JIN/SAPKs，p38MAPK，ERK）及转录因子（JUN，CREB）均有明显表达. 结论 在体外顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程中，MAPKs途径（JIN/SAPKs，p38MAPK，ERK）及转录因子（JUN，CREB）参与诱导了细胞凋亡.
Keywords:MAPKs;cisplatin;apoptosis;cell signal trans-duction;hepatoma SMMC-7721cell;FCM;im-munocytochemistry
Abstract:AIM To investigate activity changes of cell signal transduction factors（JIN/SAPKs，p38MAPK，ERK，JUN，CREB）in apoptotic hepatoma SMMC-7721cell induced by CDDP.METHODS Using immunocytochemistry and FCM methods.RESULTS After treatment with CDDP at15mg L-1 ，there were apoptotic peaks in cell cycle analysis on FCM for48h and expression of MAPKs and transcripton factors in cell plasm and/or nucleus for72h.CONCLUSION MAPKs pathway and transcription factors（JUN，CREB）are con-cerned with apoptosis of hepatoma SMMC-7721cell induced by cisplatin.
0 引言
细胞凋亡在多细胞、发生分化的动物发育过程中起到了很重要的作用［1］ .虽然细胞凋亡在一些情况下被称为细胞自杀，但多数情况下需特殊介导物或条件诱导才可产生［2］ .临床上常用的抗肿瘤药物，如顺铂、阿霉素等均可干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程，最终导致细胞凋亡［3-6］ .近年来，借助于分子生物学和遗传学手段，对凋亡产生的效应及调节机制特别是信号转导途径进行了进一步的研究，学者们逐渐认识到丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）参与了细胞凋亡的信号转导过程［7-9］ .我们在实验中使用顺铂诱导肝癌SMMC-7721培养细胞凋亡，采用免疫细胞化学法观察MAPKs（JIN/SAPKs，p38MAPK，ERK）及转录因子（JUN，CREB）在肿瘤细胞凋亡时活性的变化，探讨MAPKs途径在化疗药物介导细胞凋亡过程中的重要作用.
1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞株SMMC-7721由本校神经生物学教研室提供.
1.2 方法 细胞培养参照文献［10］.
1.2.1 流式细胞光度术分析细胞凋亡 参考近年来国内外对顺铂诱导肝脏肿瘤细胞凋亡的研究［11，12］ ，根据预实验结果，实验组以15mg L-1 浓度顺铂作用SMMC-7721细胞（106 mL-1 ）0～72h，以无药物处理的细胞为阴性对照组，加入等量培养液（100mL L-1 胎牛血清的RPMI1640培养液）常规培养，按作用时间不同，分别收集细胞，经HBSS洗涤2次，加入-4℃700mL L-1 乙醇固定过夜，离心收集细胞，再经HBSS洗涤后，依次加入膜穿孔剂，PI和RNase4℃染色30min，350目筛网过滤，Epics-profile流式细胞仪上进行DNA含量及细胞周期分析.每份标本测定（3～5）×103 个细胞，采用多参数细胞周期分析软件拟合处理对标本进行细胞周期分析.
1.2.2 免疫细胞化学染色 6孔板上放入盖玻片3片/孔，用多聚赖氨酸25g L-1 ，37℃处理2h，灭菌水或PBS洗涤3次，在紫外灯下吹干，接种细胞，100～500个/片，处理组加入终浓度15mg L-1 顺铂培养液，对照组加入等量细胞培养液，分别培养6，12和72h，在不同时间点将玻片上的培养液倾去，0.01mol L-1 PBS洗，加入pH7.4，40mL L-1 多聚甲醛固定10min，0.01mol L-1 KPBS洗涤15min（5min×3次），再用3mL L-1 h3 O2 （用800mL L-1 甲醇配制）封闭玻片30min，以消除内源性过氧化物酶，结束后用0.01mol L-1 PBS洗3次（10min/次），然后依次加入兔抗Jnk，p38，CREB，ERK，Jun（用血清稀释液1 500稀释4℃孵育48h），生物素化的羊抗兔IgG（1 500室温12h）及ABC复合物（1 500室温4h），以上每一步骤均用0.01mol L-1 PBS（pH7.6）洗涤，10min×3.最后在含有0.5g L-1 DAB，5g L-1 硫酸镍铵和0.1mL L-1 h3 O2 和0.1mL L-1 醋酸缓冲液冲洗（pH6.2）中呈色直至颜色适度为止，约需10～15min，玻片在室温下晾干，用甘油封片，在Olymmpus BH60显微镜下观察并照相.
2 结果
2.1 细胞形态学变化 与对照组相比，SMMC-7721细胞在15mg L-1 顺铂作用下，12h时开始出现凋亡的形态学的改变，24h凋亡细胞增多，48h凋亡细胞明显增多，72h伴有大量细胞死亡.
2.2 细胞周期分布 以15mg L-1 顺铂作用肝癌SMMC-7721细胞0～72h，形成正常二倍体细胞DNA峰（G1 峰）之前的亚二倍体峰，即Apoptosis峰（亦称Ap峰），是凋亡细胞核固缩及DNA降解的结果，根据Ap峰可测凋亡细胞占细胞总数的比例，Fig1A示15mg L-1 顺铂作用48h后G1 峰前出现凋亡峰sub-G1 ，占细胞总数的3.35%，而阴性对照组细胞G1 峰前无凋亡峰出现（Fig1B）.
图1 SMMC-7721细胞周期分布的FCM分析 略
2.3 免疫细胞化学检测结果 以15mg L-1 顺铂作用SMMC-7721细胞72h，JUN，CREB实验组细胞染色显示胞核出现特异性染色（Fig2A）;JIN/SAPKs，p38MAPK实验组细胞染色显示黑色颗粒分布于部分或整个细胞核及近核部位，胞质浅染（Fig2B）;ERK实验组细胞染色显示黑色颗粒分布于胞核及胞质内，细胞核及胞质着色加深（Fig2C）;对照组细胞染色核周区黑色颗粒明显，细胞核散在点状淡染（Fig2D）.
近年来研究表明，MAPK三酶级联反应是哺乳动物细胞中重要的信号通路［13-15］ .根据双磷酸化激活的MAPK种类不同，哺乳动物细胞中MAPKs途径大致分为4种:ERK1/2途径、JNK途径、p38途径、ERK5途径.在胞质中，MAPKs级联反应至少包含3个顺序激活的部分:MAPKKK，MAPKK，MAPK，其底物绝大多数是核内转录因子.许多细胞外信号通过不同的途径激活不同的MAPKs家族成员，介导不同的反应，而各反应之间还存在交叉，使MAPK级联反应成为一个复杂的网络系统.细胞外信号通过MAPKs来诱导或活化c-Fos和c-Jun等转录因子，形成异源二聚体形式的转录复合物，即活化蛋白AP-1，与DNA中的TPA反应元件结合，促进基因的转录.CREB即CRE结合蛋白，它能与DNA中cAMP反应位点结合.本实验中，运用免疫细胞化学染色可见肿瘤细胞发生凋亡时胞质或（和）胞核中MAPKs（JIN/SAPKs，p38MAPK，ERK）及转录因子（JUN，CREB）均有明显表达，证明在此MAPKs作为细胞质和细胞核信号之间的枢纽，在介导肿瘤细胞凋亡过程中起着重要的作用.目前还很难概括出MAPKs家族的具体功能，在不同的细胞及不同的刺激条件下，MAPK途径介导的功能也不尽相同.最近有人用金丝桃素对肿瘤进行光动力学治疗，发现金丝桃素诱导Hela细胞凋亡过程中，JNK1和p38虽然大量激活，但以抑制剂阻断其活性却促进了细胞的凋亡，这提示JNK1和p38的激活并非Hela细胞调亡的诱因而是起对抗凋亡作用.另外在B细胞中ERK和JNK/SAPKs对凋亡起相反作用，JNK/SAPKs保护细胞，而ERK促进细胞凋亡;而在其他模型中，ERK和JNK/SAPKs之间的阴阳关系依然存在，但JNK/SAPKs则促进而不是抑制细胞凋亡.我们在实验中发现JIN/SAPK，p38MAPK，ERK三条途径均诱导促进了肝癌SMMC-7721细胞的凋亡.
图2 免疫细胞化学检测结果 略
关于抗癌药物对肿瘤细胞的凋亡作用，在国内外已成为热点.顺铂是多种联合化疗方案的核心药物，大量体外实验研究表明顺铂对多种肿瘤细胞有诱导凋亡作用［16-18］ ，但其作用机制尚不完全清楚，本实验发现MAPKs途径参与了顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡.此外我们在预实验中发现顺铂诱导肝癌细胞凋亡存在明显的量效和时效关系，当顺铂浓度≥10mg L-1 ，作用肝癌SMMC-7721细胞24h，应用流式细胞仪即可检测到凋亡峰，当浓度增加到30mg L-1 时凋亡细胞达75%，结合本实验，我们最终选用15mg L-1 作为终实验浓度.
随着对细胞凋亡和信号转导研究的不断深入，人们可能对由于细胞凋亡异常引起的疾病如癌症、自身免疫疾病进行治疗，由此引发医学领域的快速发展.
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