作者：廉凯 杜靖远 饶振玉 罗怀灿
【关键词】 破骨细胞
关键词: 降钙素基因相关肽;成骨细胞;破骨细胞;白细胞介素-1
摘 要:目的 了解白细胞介素-1β（IL-1β）在破骨细胞性骨吸收中的刺激作用，并评价降钙素基因相关肽（CGRP）的拮抗效果. 方法 将新生大鼠破骨细胞和成骨细胞混合培养，接种于预置象牙片的培养板中.24h后培养液中分别加入IL-1β和不同浓度的CGRP.继续培养48h，然后取出象牙片，超声处理后行甲苯胺蓝染色，光镜下观察骨吸收陷窝数目并计算其总面积. 结果 IL-1β明显增加象牙片上吸收陷窝的数目（37.2±8.2vs22.4±5.7）per slice（P&<0.01）和面积（μm2 ，9761±2775vs4224±1381，P&<0.01），而CGRP则能够显著抑制IL-1β的刺激作用（P&<0.05或P&<0.01），且抑制作用呈剂量依赖性（r1 =-0.56，P&<0.01;r2 =-0.49，P&<0.05）. 结论 CGRP可直接作用于破骨细胞并抑制其活化，并调节成骨细胞相关因子的释放而间接影响破骨细胞功能.
Keywords:calcitonin gene-related peptide;osteoblast;osteo-clast;interleukin-1
Abstract:AIM To investigate the effects of interleukin-1β（IL-1β）on bone resorption in vitro，and to evaluate the inhi-bitory effect of CGRP.METHODS The osteoclasts isolated from the long bones of newborn SD rats were co-cultured with osteoblasts on ivory slices placed in24-well plates.Twenty-four hours later，conditioned media containing CGRP and/or IL-1βwere added to the wells respectively，and the culturing continued for48h.After the cells were stripped off by ultrasonication，the ivory slices were stained in toludine blue.The number of resorption lacunae on each slice was counted under light microscope and the area was measured by computer imaging analysis system.RESULTS IL-1βstimu-lated significantly bone resorption as shown by increased numbers（37.2±8.2vs22.4±5.7per slice，P&<0.01）and areas of resorption lacunae（μm2 ，9761±2775vs4224±1381，P&<0.01）on slices，but CGRP inhibited the effects mediated by IL-1βin a dose-dependent manner（r1 =-0.56，P&<0.01;r2 =-0.49，P&<0.05）.CONCLUSION CGRP may inhibit osteoclastic bone resorption through a direct function on osteoclasts to block their activation，and regulate the release of cytokines by osteoblasts thus affecting indirect-ly the function of osteoclasts.
0 引言
破骨细胞是骨吸收过程的效应细胞，其生成、活化及其在骨吸收中的作用受细胞因子和细胞间相互作用所调节.IL-1是一种骨吸收刺激因子，可在多种骨吸收性疾病中异常地增高，其作用的方式是由成骨细胞或骨髓基质细胞介导，而非直接作用于破骨细胞.我们采用体外成骨细胞和破骨细胞联合培养的方法来观察IL-1对破骨细胞性骨吸收的刺激作用以及降钙素基因相关肽（CGRP）的拮抗效果.
1 材料和方法
1.1 材料 大鼠降钙素基因相关肽α（rCGRPα，Sig-ma产品），大鼠白细胞介素-1β（rIL-1β，Sigma产品），出生24h内的SD大鼠（同济医科大学实验动物中心提供），MEM培养基及胎牛血清（Gibco公司），HEP-ES、青霉素、链霉素及甲苯胺蓝（均为Merck公司），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒（中国医学科学院血液病研究所产品）;无菌象牙片（6mm×6mm大小，30μm厚）、盖玻片.实验分组为对照组、IL-1刺激组（rIL-1β浓度为10μg・L-1 ）和治疗组（rCGRP的终浓度为10-9 ，10-8 ，10-7 ，10-6 mol・L-1 ，其中各组均含rIL-1β10μg・L-1 ）.
1.2 方法
1.2.1 破骨细胞的培养 取新生SD大鼠，拉颈处死，750mL・L-1 乙醇浸泡5min，分离其股骨、肱骨和胫骨，清除骨表面软组织和骨骺，骨干部分放入盛有MEM培养液（含150mL・L-1 胎牛血清、25mmol・L-1 HEPES缓冲液、100kU・L-1 青霉素、100kU・L-1 链霉素、pH7.0～7.1）的玻璃平皿中，用解剖刀纵剖后将骨质内表面轻轻刮入培养液，吸管反复冲打骨质碎片2min，静止30s后，收集上清，调整细胞浓度为1×109 ・L-1 ，再均匀接种于预置盖玻片和象牙片的6孔板中（此前已加MEM培养基预培养2h）.常规培养（37℃，50mL・L-1 CO2 、饱和湿度）30min后，用MEM培养液冲掉未贴壁细胞，更换培养液继续培养，8h后取出盖玻片，行破骨细胞形态学鉴定，48h后取象牙片行骨吸收陷窝的扫描电镜鉴定.破骨细胞的鉴定:①倒置显微镜观察:观察培养细胞的形态及运动情况;②破骨细胞TRAP染色:将含细胞盖玻片经10mL・L-1 戊二醛4℃固定10min，冲洗后置入TRAP孵育液，37℃孵育50min，蒸馏水冲洗，甘油明胶封片;③骨吸收陷窝扫描电镜（SEM）观察，将象牙片用0.25mol・L-1 NH4 OH超声处理15min，以除去象牙片上生长的细胞，然后用25mL・L-1 戊二醛固定2h，10mL・L-1 锇酸固定后，系列乙醇脱水，醋酸异戊酯置换乙醇，二氧化碳临界点干燥、镀金，日立S-520扫描电镜（15KV）观察象牙片上的陷窝.
1.2.2 成骨细胞的培养 采用2次胶原酶消化培养方法，将1d龄新生SD大鼠置入750mL・L-1 乙醇中浸泡消毒5min，无菌操作下完整取出颅盖骨，清理洗涤干净后，用1mL・L-1 Ⅰ型胶原酶（Sigma公司）分别于室温静置、37℃剪碎振荡消化30min和20min.收集第二次消化的细胞悬液，1000r・min-1 离心10min，弃上清，用少量含200mL・L-1 胎牛血清（FCS）的DMEM（Gibco公司）培养液（含青霉素和链霉素各100kU・L-1 ）将细胞吹打均匀，按1×108 ・L-1 接种于培养瓶中，常规条件培养，2～3d换液1次，至7～9d细胞汇合后消化传代.实验采用第二代成骨细胞，浓度为2×107 ・L-1 .
1.2.3 破骨细胞和成骨细胞混合培养及骨吸收陷窝 的观察 将上述方法分离之破骨细胞接种于24孔培养板中，每孔预先放置2块象牙片，30min后振荡象牙片，并用MEM冲洗掉未贴壁细胞，更换培养液，每孔加入MEM/FCS1.5mL和成骨细胞悬液0.5mL，共同培养24h.再次换液并分别加入rIL-1β和rCGRP，使终浓度达到IL-1刺激组和各治疗组所需的IL-1β和CGRP浓度.继续培养48h后取出各孔象牙片，用25mL・L-1 戊二醛固定10min，于0.25moL・L-1 NH4 OH溶液中超声清洗5min×3次，系列乙醇脱水，自然晾干.1g・L-1 甲苯胺蓝染液室温染色3～4min，蒸馏水清洗后光镜下观察，100倍下对整张象牙片作陷窝计数，结果以陷窝数/象牙片表示，并利用MPIAS-500多媒体图像分析系统测定每张象牙片骨吸收陷窝的面积（单位为μm2 ），每组6片.统计学处理:实验数据以x ±s表示，作t检验和直线相关分析.
2 结果
2.1 培养破骨细胞的鉴定 倒置显微镜下，作为破骨细胞来源的细胞悬液中含有破骨细胞和大量其他类型的细胞.经短暂培养后换液，除破骨细胞外其他大部分细胞均被冲洗掉.贴壁之破骨细胞含多个细胞核，培养2h后胞质伸展，形态清晰，呈油煎蛋形，长条形、漏斗形及不规则形等，细胞形态随培养时间延长而不断变化.TRAP为破骨细胞特异性标志酶，光学显微镜下TRAP染色显示破骨细胞胞质呈红色的阳性反应，核阴性（Fig1）.成骨细胞与破骨细胞混和培养24h后，取象牙片经甲苯胺蓝染色可见成骨细胞和破骨细胞共同生长，且两细胞间通过胞质突起而相互接触（Fig2）.骨吸收陷窝形成是破骨细胞的特异性功能标志，扫描电镜结果显示，骨吸收陷窝呈圆形、椭圆形或不规则形，陷窝边界清晰，底面粗糙不平，有纤维样基底（Fig3）.
2.2 骨吸收陷窝数目及吸收面积 取出成骨细胞与破骨细胞混和培养3d的象牙片经甲苯胺蓝染色后在光镜下观察，可见吸收陷窝呈蓝紫色圆形、椭圆形或腊肠形等各种形态，边界清楚，陷窝底纤维纹路隐约可辨（Fig4）.当培养液中加入IL-1β后（浓度为10μg・L-1 ），可以使象牙片上吸收陷窝的数目和面积较对照组明显增加（P&<0.01）.而加入不同浓度的CGRP则能一定程度上抑制IL-1β的刺激作用，尤其以10-7 mol・L-1 和10-6 mol・L-1 CGRP作用显著（与IL-1β刺激组相比，P&<0.05和P&<0.01），这种抑制作用呈剂量依赖性，CGRP浓度和吸收陷窝数目有明显的负相关（r1 =-0.56，P&<0.01），CGRP浓度和吸收陷窝面积也呈显著的负相关（r
2 =-0.49，P&<0.05，Tab1）.
图1 －图4 略
表1 降钙素基因相关肽对IL-1β刺激骨吸收陷窝数目和面积的影响 略
3 讨论
破骨细胞来源于单核巨噬细胞系统的造血干细胞，并在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、白细胞介素-3（IL-3）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的诱导下演变为成熟的破骨细胞，其典型特征为多核、富含TRAP、有丰富的降钙素受体以及在骨薄片上可形成骨吸收陷窝等［1，2］ .我们采用新生大鼠长骨机械分离方法，并通过活体观察、贴壁细胞TRAP特异性染色以及典型骨吸收陷窝的SEM观察，证实所培养的细胞具有明显的破骨细胞特征.成骨细胞在破骨细胞的诱导和活化过程中发挥重要作用［3］ .IL-1主要来源于单核细胞和巨噬细胞，具有较强的刺激骨吸收活性和抑制骨形成作用，在绝经后骨质疏松症的发生中起重要作用［4］ .IL-1在骨吸收中的作用机制尚不十分清楚，目前研究认为，IL-1首先作用于成骨细胞，刺激后者合成和分泌细胞因子以旁分泌调节方式或者通过细胞间连接、接触以直接传递信息的方式来促进破骨前体细胞的分化成熟和成熟破骨细胞的活化，从而发挥其促进骨吸收的作用［5，6］ .而IL-1对不伴成骨细胞存在的破骨细胞性骨吸收则缺乏明显的刺激作用［7］ .我们发现，10μg・L-1 IL-1β可以明显增加象牙片上骨吸收陷窝的数目和面积，因而证实IL-1β的刺激骨吸收作用.
致 谢 上海市放射医学研究所王洪复教授、高建军博士在实验中提供帮助和指导.
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