作者：秦绪军 何伟 海春旭 梁欣 张晓迪 赵康涛 陈宏莉 刘瑞
【关键词】 荷瘤鼠，
关键词: 抗氧化剂;60 Coγ射线;照射;氧化损伤;荷瘤鼠
摘 要:目的 探讨荷瘤大鼠60 Coγ射线局部照射时血液学氧化损伤以及复合抗氧化剂抗损伤作用. 方法 采用Walk-er-256肿瘤细胞株接种大鼠皮下，得到实体瘤，摘除实体瘤分割成小块植入大鼠的右后腿皮下，制成大鼠荷瘤模型，将荷瘤大鼠分成3组，分别为肿瘤组、照射组和抗氧化剂保护组，同时选取正常大鼠作为阴性对照组.抗氧化剂保护组每日给予复合抗氧化剂ig，分次对照射组和抗氧化剂保护组的荷瘤大鼠进行60 Coγ射线局部照射4次，每次间隔1wk，累计剂量为47Gy，最后一次照射后7d，活杀大鼠，取全血和血清测定过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和总蛋白. 结果 照射组的MDA含量显著高于非照射组和抗氧化剂保护组（347μmol g-1 vs292，305和196μmol g-1 ，P&<0.05），复合抗氧化剂显示出良好的保护作用.而照射组的抗氧化酶类如总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性显著低于非照射组和抗氧化剂保护组（3.65μkat g-1 vs4.05，4.82和4.70μkat g-1 ，P&<0.05），CAT的活性在照射组显著低于肿瘤组和抗氧化剂保护组（362K g-1 vs677和672K g-1 ，P&<0.05）. 结论 60 Coγ射线局部照射可以产生自由基引发的全身氧化损伤，高效的复合抗氧化剂可以起到有效的保护作用.
Keywords:antioxidants;60 Coγ-irradiation;radiation;oxida-tive injury;rats with tumor
Abstract:AIM To observe the oxidative injury of rats with tumor by local60 Coγ-irradiation and the protection of antiox-idants compound.METHODS The SD rats were pided in-to control group as negative control group（NCG）and experi-mental groups（TG，RG and PG）.The tumor cell strain Walker-256was injected into the rat to get the entity tumors which were cut into small pieces and were embedded into the right rear buttocks under skin of rats.As the embedded tu-mor had grown up successfully，they were randomly pided into3groups which were tumor group（TG），radiation group（RG）and radiation plus protection group（PG）.The PG was given antioxidants compound by gavage and other groups were given the same dosage water.RG and PG were locallyγ-irradiated with the total doses of47Gy，then all the rats were sacrificed and the bloods collected to measure the con-tent of serum malondialdehyde（MDA），the activities of the total superoxide dismutase（T-SOD）and the catalase（CAT）.RESULTS The content of MDA in RG is much higher than that in all the other groups（347μmol g-1 vs292，305and196μmol g-1 ，P&<0.05）.The activities of SOD and CAT in RG are much lower than those in the TG and RPG（3.65μkat g-1 vs4.05，4.82and4.70μkat g-1 ，362K g-1 vs677and672K g-1 ，P&<0.05）.CONCLUSION Local radiation can cause the oxidative injury on the domes-tic system of the rats and the antioxidant compound shows a protective effect against this injury.
0 引言
射线照射可以产生自由基，进攻损伤细胞结构，使用抗氧化剂有一定保护作用［1，2］ ，但对于局部照射引起机体氧化损伤的程度，以及通过给予抗氧化剂是否可以避免或预防局部照射引起的周身氧化损伤报道不多.通过高效复合抗氧化剂的补充，观察60 Coγ射线局部照射对全身的损伤效应以及抗氧化剂的保护作用.
1 材料和方法
1.1 材料 二级雄性SD大鼠40只，体质量（219±15）g，由第四军医大学实验动物中心提供.复合抗氧化剂由中药安体欣（12g L-1 ）加上维生素E（20g L-1 ）改造而成.Walker-256瘤细胞株由西安交通大学医学院生化教研室惠赠.丙二醛（MDA）标准品、硫代巴比妥酸（TBA）系Merk产品.氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、牛血清白蛋白（BSA）和考马斯亮蓝G-250由上海生物化学试剂进出口公司提供.970CRT荧光分光光度计、722型光栅分光光度计均为上海分析仪器总厂产.
1.2 方法 Walker-256瘤细胞株（细胞数为5×106 个）接种于SD大鼠腹腔，约1wk后有腹水生成，无菌条件下抽取血性腹水，接种于体质量为100g的大鼠腹股沟皮下，1wk以后即可长成约1cm3 大小的实体肿瘤.将荷瘤大鼠断颈处死，无菌条件下剥离出肿瘤组织，挑选无出血、无坏死的肿瘤组织，置于生理盐水中，选取肿瘤边缘生长旺盛的鱼肉样组织块，用小眼科剪分成若干直径为1.5cm的肿瘤块，置于盛有约10mL的无血清1640培养基的无菌的表面皿内，4℃保存备用.将SD大鼠30只用1g L-1 戊巴比妥钠3mL kg-1 ，ip麻醉.侧卧位，用碘酒、乙醇消毒大鼠右后腿背侧皮肤，用眼科剪剪开长约0.6cm的皮肤切口，同时剪开其皮下结缔组织，将事先准备好的肿瘤块于无菌条件下植入，缝合切口，消毒后放回鼠笼，饲养同前.肿块接种10d后，将肿瘤移植生长良好的18只大鼠按肿瘤块大小均衡的原则随机分成3组，每组6只.同时挑取体质量相当的正常SD大鼠6只作为阴性对照组.分别为阴性对照组（Negative）、肿瘤组（Tumour）、单纯放射组（Radiative）和抗氧化剂保护组（Protective）.10d后起放射保护组每日给予复合抗氧化剂（安体欣60mg kg-1 +VE 20mg kg-1 ）ig，其余给予相同比例剂量的三蒸水，直至实验动物处死前1d.单纯放射组和放射保护组每周用60 Coγ射线照射1次，照射时用自制的4.5cm厚的铅砖进行屏蔽，铅砖上开有一直径为2.0cm的圆孔，仅露出大鼠腿部的肿瘤，照射累计剂量为47Gy（分4次照射，间隔7d，照射剂量率为10.8833Gy min-1 ，剂量依次分别为10，10，12和15Gy）.在最后1次照射后7d，将大鼠断颈取血，分别检测血清MDA含量（采用改进后的硫代巴比妥酸荧光法）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）（采用改良的盐酸羟胺法）和全血过氧化氢酶（CAT）（采用改良的比色法）的活性，总蛋白采用考马斯亮蓝G-250染色法.
统计学处理:由统计软件SPSS（Windows10.0版）oneway ANOVA中的LSD统计分析.
2 结果
单纯照射组血清中的MDA含量显著高于非照射组和照射保护组（P&<0.05），T-SOD活性显著低于肿瘤组和照射保护组（P&<0.05），与阴性对照组相比较，肿瘤组和照射保护组血清的T-SOD活性又显著升高（P&<0.05）.单纯放射组的抗凝全血的CAT的活性显著低于肿瘤组和照射保护组（P&<0.05），而肿瘤组和照射保护组的CAT的活性又显著高于阴性对照组（P&<0.05，Tab1）.
3 讨论
放射线照射可以引发自由基损伤，但以往绝大多数研究都集中在全身照射［1-3］ .从实验结果可以看到，照射组的MDA的含量显著高于非照射组（P&<0.05），说明局部照射确实可以引起全身的氧化损伤，这可能是照射引起的自由基通过自由基的链式反应以及自由基随血液流遍全身造成的.同时照射保护组的MDA含量较照射组显著降低（P&<0.05），提示局部照射引起的自由基损伤可以通过全身的复合抗氧化剂补给而得到防护.我们还可以看到，肿瘤组的MDA含量高于阴性对照组，说明荷瘤大鼠体内自由基水平要高于正常大鼠水平，这也提示，肿瘤的发生、发展过程中与自由基代谢密切相关.而给予抗氧化剂的保护组其MDA水平比肿瘤组还要低，这种现象可能是抗氧化剂清除了电离辐射产生的自由基的同时，也清除了一部分肿瘤自身代谢的自由基.照射组的T-SOD活性较肿瘤组显著减低（P&<0.05），因为电离辐射对抗氧化酶活性的影响随照射剂量和照射周期不同而迥异.本研究室以前的工作发现，照射损伤的急性期可以引起T-SOD活性的升高，可能是因为T-SOD是一种诱导酶［4，5］ ，由于氧化损伤急性期产生的超氧阴离子自由基的增多而导致T-SOD的活性增强，但照射损伤又可累及抗氧化酶生成，破坏正常酶的活性作用，结果导致酶的活性降低.从本实验看，连续照射4次，每次间隔1wk，历时35d，抗氧化剂保护组的T-SOD活性显著高于照射组，这其中可能与抗氧化剂清除了电离辐射产生的自由基相关，因为抗氧化剂的存在，而使得照射对生物酶诱导生成作用增强，存在自我对抗性的保护作用，但另一方面，由于自由基的存在，对T-SOD有一定的诱导作用，从而出现照射保护组的T-SOD活性较肿瘤组更高.同时，肿瘤组的T-SOD活性高于阴性对照组，肿瘤相关的自由基代谢的高水平虽不能达到破坏产生生物酶的结构，但持续的低水平的增高可以诱导抗氧化酶的升高，这与前面各组MDA含量的变化相吻合.各组实验动物的全血CAT的活性也有了很大的差别，照射组的CAT的活性显著低于肿瘤组（P&<0.05），各组的酶的活性变化趋势与T-SOD一致.T-SOD的作用是歧化超氧阴离子自由基（- O2 ）为过氧化氢和水，而过氧化氢酶将过氧化氢催化反应最后生成CO2 和h3 O
2 .可见T-SOD和CAT是同一功能系统的不同阶段部分，电离辐射照射及抗氧化剂的给予对二者的活性变化的影响是一致的.照射组的CAT活性低于肿瘤组同样验证了长期照射对抗氧化酶的活性的影响，而照射保护组的CAT的活性显著高于照射组也进一步说明了复合抗氧化剂的有效保护作用.
参考文献:
［1］Konopacka M，Rzeszowska-Wolny J.Antioxidant vitamins C，E and beta-carotene reduce DNA damage before as well as after gamma-ray irradiation of human lymphocytes in vitro ［J］.Mutat Res，2001;491（1-2）:1-7.
［2］Wang L，Hai CX，Qin XJ.Protective effect of vitamin A and vi-tamin E on peroxidative damage induced by radiation in rats ［J］.Jiefangjun Yufang Yixue Zazhi（J Pre Med Chin PLA），2001;19（2）:98-100.
［3］Liang X，Hai CX，Zhao KT，Qin XJ.Effect of Vit.C，Vit.E on peripheral blood composition and dose-effect relationship in rab-bit injured by irradiation of 60 Co gama rays ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2002;23（2）:187-190.
［4］Sun J，Chen Y，Li M，Ge Z.Role of antioxidant enzymes on ionizing radiation resistance ［J］.Free Radic Biol Med，1998;24（4）:586-593.
［5］Agrawal A，Kale RK.Radiation induced peroxidative damage:Mechanism and significance（Review）［J］.Indian J Exp Biol，2001;39（4）:291-309.转贴于