作者：苏明 窦科峰 赵爱志 李福洋
【关键词】 DNA/分离和提纯，
关键词: 柱式胶回收试剂盒;DNA/分离和提纯
摘 要:目的 确定提高柱式胶回收试剂盒DNA回收效率的最佳条件. 方法 回收的基本步骤遵循试剂盒附带的厂家说明，在此基础上，改变其中所用试剂的剂量，或者添加原试剂盒中没有的试剂，并在不同条件组合下分别进行DNA回收.电泳后，通过比较条带的亮度来比较不同条件下DNA回收效率的大小，逐步确定最佳的胶回收条件. 结果 提高柱式胶回收试剂盒DNA回收效率的最佳条件为:切胶要尽量的小;每l g胶用600μL的S1;溶胶时间:55℃，10min;沉淀时加入3/5总体积的异丙醇和1/10总体积的乙酸钠（3mol L-1 ，pH5.2）;沉淀时间20min;沉淀温度为25℃（室温）;用T1液溶解效率高于用水溶;溶解时间为20min（55℃）.这些最佳条件中，大部分都对原来的条件进行了改良. 结论 应用了改良后的胶回收条件后，胶回收的效率提高到原来的3～4倍.
Keywords:gel extraction kit;DNA/isolation&&purification
Abstract:AIM To determine the optimal conditions for high DNA extraction efficiency from gels with gel extraction kit.METHODS The basic procedure of isolation of DNA from agarose gels were carried out essentially as described by the manufacturer.We changed the dosage of several reagents or added new reagent that was not included in the kit previ-ously and we made several different combining of these reagents.Then after electrophoresis，the optimal conditions for DNA extraction were determined ultimately by comparing the brightness of bands.RESULTS The optimal conditions for high DNA extraction from gels using gel extraction kit were:The desired fragments of DNA as small a slice of gel as possible;600μL S1solution per100mg gel;10min of dis-solving time（55℃），0.6volume isopropanol and1/10vol-ume sodium acetate（3mol L-1 ，pH5.2）during precipita-tion;20min of precipitation time;25℃of precipitation tem-perature（room temperature）;T1solution during elution tather than water;20min of dissolution time（55℃）.Most of the conditions described by the manufacturer were modi┐fied.CONCLUSION The DNA extraction efficiency from a-garose gels is improved3～4times.
0 引言
在抗体库的构建过程中，DNA回收效率的高低对所构建抗体库的质量有十分重要的意义［1-4］ ，如果DNA回收效率太低，会大大增加工作量，并将有可能损失样本的多样性，进而损害抗体库的质量.我们探讨了如何提高胶回收试剂盒的DNA回收效率，试图摸索出一套能够提高胶回收试剂盒DNA回收效率的最佳回收条件.
1 材料和方法
1.1 材料 胶回收试剂盒:由上海华舜生物工程有限公司生产;电泳仪:由大连捷迈科贸有限公司生产（JM-250型）;质粒pDAN5:由意大利Andrew Brad-bury教授赠送;凝胶成像仪:为Alpha Innotech Cor-poration生产的Alpha-1200型;琼脂糖:由华美生物工程公司生产.
1.2 方法 每一次回收时，均先取0.5μL的pDAN5质粒（0.7g L-1 ）电泳，之后对其进行回收，以试剂盒附带的说明作为回收操作的基本步骤，在此基础上，我们改变其中所用试剂的剂量，或者添加新的试剂，并在不同的条件组合下分别进行胶的回收.回收后，行DNA电泳，通过比较各条带的亮度来确定不同条件下DNA回收效率的大小，逐步摸索最佳的DNA回收条件，最终确定在原有试剂盒的基础上，能够提高其回收效率的最佳条件.为最大限度地溶胶、沉淀及溶解，我们先延长各项操作时间分别为溶胶时间:20min，沉淀时间:30min，溶解时间:30min，直到分别确定出各项操作所需的充分、必要的时间长度.
2 结果
2.1 确定S1和异丙醇的用量 在不同的S1和异丙醇用量下分别进行胶回收，然后电泳.结果（Fig1）表明:在每一特定的S1用量下，加入3/5总体积的异丙醇的回收效率均高于加入3/10总体积的异丙醇的回收效率.［②&>①，④&>③，⑥&>⑤，⑧&>⑦］，其中⑥孔的亮度最高.因此，溶胶时每100mg胶加入600μL S1溶液，沉淀时加入3/5总体积的异丙醇，DNA的回收效率最高.
图1 不同S1和异丙醇用量下的胶回收结果 略
2.2 加入乙酸钠（3mol L-1 ，pH5.2）对DNA回收的作用 将加和不加乙酸钠的胶分别回收进行比较，电泳后，结果（Fig2）表明:在每一特定的S1用量下，加乙酸钠后的DNA回收效率均高于不加乙酸钠时的回收效率.［②&>①，④&>③，⑥&>⑤，⑧&>⑦］因此，加入乙酸纳能够提高DNA的回收效率.
2.3 沉淀温度 在不同的温度（-20℃，25℃，55℃）下进行胶回收，电泳后，结果（Fig3）表明:②&>③&>①，因此，沉淀温度以25℃（室温）较为适宜.
2.4 沉淀时间（25℃） 在不同沉淀时间（10，15，20和25min）下进行胶回收，电泳后，结果（Fig4）表明:随着沉淀时间的延长，回收产物也逐渐增加，而20min与25min结果相近.出于节约时间的考虑，20min的沉淀时间较为适宜.
2.5 溶解时间:（55℃） 在不同的溶解时间下进行 胶回收，每一长度时间下，分别溶解2次，电泳后，结果（Fig5）表明:随着时间的延长，第1次溶解所得条带亮度逐渐增强［①&<③&<⑤&<⑦］.相反，第2次溶解产物（即:第1次溶解后残留在滤膜上的核酸）的亮度却在不断降低［②&>④&>⑥&>⑧］.溶解20min后，第2次的溶解产物［⑧］已无法看到，说明已达到了充分溶解.因此，溶解时间以20min较为适宜.
2.6 用水溶和用T1溶的比较（55℃，20min） 分别用水或者T1液进行溶解，电泳后，结果（Fig6）表明:在每一特定的溶解时间下，T1液的溶解效率均高于水的溶解效率［①&>②，③&>④，⑤&>⑥，⑦&>⑧］.因此，用T1液进行溶解将获得较高的回收效率. 2.7 溶胶时间的长短 在不同的溶胶时间（20，15，10和5min）下进行胶回收，电泳后，结果（Fig7）表明:①②③孔的条带亮度较相似，明显高于④孔的亮度.说明，10min即可使胶得到充分的溶解，因此，10min的溶胶时间较为适宜.
图6 － 图7 略
2.8 切胶的质量大小 在不同的切胶质量情况（50，70，100，300，500和800mg）下进行胶回收，电泳后，结果（Fig8）表明:①②③④⑤孔的条带亮度较相近，说明当切胶质量比较小时，对回收效率的影响不大.但是，⑥孔的条带亮度明显降低，说明当切胶质量比较大时，将明显降低胶的回收效率.因此，切胶质量要尽量的小.
图8 略
3 讨论
在分离酶切的DNA片段过程中，琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法.而方便快捷的回收方法及高的DNA回收效率在分子克隆中是十分重要的［5-9］ .尤其在构建抗体库的过程中，为了不丢失样品的多样性，减少工作量，高的DNA回收效率显得更加必要.而对于回收的方法，则有许多种，如:玻璃绒法、纸浆法、吸墨纸法及目前通常使用的柱式胶回收试剂盒［10］ .其中，试剂盒的便捷性是众所周知的，但是，常用的试剂盒由于较低的回收效率而令人感到失望.因此，如何在试剂盒的基础上进一步提高DNA的回收效率就成为必须解决的问题.我们把核酸沉淀时常用的方法（如:乙酸钠溶液的加入［11］ ）应用到试剂盒的胶回收中，大大提高了DNA的回收效率，使回收效率在原来试剂盒的基础上，提高了3～4倍.而在溶胶、沉淀、溶解的时间方面，虽然较长的时间可以做到充分的溶胶、沉淀、溶解，但是为了提高工作效率，通过不断的试验，来摸索最佳的时间长度是必要的.本文中的时间，都是通过反复的试验，逐渐摸索出来的，是在所用条件下的最短必要时间，另外，操作中要注意［12］ :加入异丙醇的速度一定要缓慢，并且要不断摇动离心管.因为如果加入过快或者加入的异丙醇超过了4/5总体积，将会导致琼脂糖的沉淀，降低胶的回收效率.在试验中，我们还观察到:从胶中回收DNA时，-20℃沉淀温度的回收效率要低于室温的回收效率，但是在没有胶参与的DNA沉淀时，-20℃的沉淀温度与室温情况下的回收效率相同.我们推测可能是由于低温导致琼脂糖的沉淀，最终导致DNA回收效率的降低.
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