关键词: 微核;胸腔积液;染色体，人;染色体畸变
摘 要:目的 探讨胸水中淋巴细胞微核率（PFLMNF）对良、恶性胸腔积液鉴别诊断的意义. 方法 对良、恶性胸腔积液患者及健康人各20例采用细胞分裂阻滞微核（CB-MN）法检测外周血淋巴细胞微核率（PBLMNF）及用丝裂霉素C（MMC）诱发PBLMNF，直接用光镜观察PFLMNF. 结果 PFLMNF与PBLMNF有良好的相关性（r=0.935，P&<0.01）.恶性胸腔积液患者自发PBLMNF及诱发PBLMNF均显著高于对照组和良性胸腔积液组（P&<0.01）.良性胸腔积液组PBLMNF与对照组无统计差异（P&>0.05）.恶性胸腔积液组PFLMNF较良性胸腔积液组明显升高（P&<0.01）. 结论 PFLMNF检测方法简单、快速、实用，并可以代替PBLMNF检测，PFLMNF检测可成为良、恶性胸腔积液鉴别诊断的一种有实用价值的方法.
Keywords:micronuclei;pleural effusion;chromosomes，hu-man;chromosome aberrations
Abstract:AIM To investigate the significance of pleural fluid lymphocyte micronuclei frequency（PFLMNF）for diag-nosis of malignant pleural effusion and benign pleural effu┐sion.METHODS The modified cytokinesis-blocked mi-cronucleus（CB-MN）technique was used to determine pe-ripheral blood lymphocyte micronuclei frequency（PBLMNF）and mitomycin C（MMC）-induced PBLMNF in20cases with benign pleural effusion，20cases with malignant pleural effu-sion and20health controls，while PFLMNF was investigated in the40patients at the same time.RESULTS There was a better correlation between PFLMNF and PBLMNF（r=0.935，P&<0.01）.Spontaneous PBLMNF and MMC-induced PBLMNF of the malignant effusion group were much higher than that of the benign effusion group or the control group（P&<0.01）.However，PBLMNFs in the latter two groups had no statistic difference（P&>0.05）.PFMNF in the malig-nant effusion group were significantly higher than that in the benign group（P&<0.01）.CONCLUSION PFLMNF test，which is a simple，fast，practical method，can be used to re-place the PBLMNF test.It is a practical diagnostic method for malignant pleural effusion and benign pleural effusion.
0 引言
胸腔积液常规方法多能定性诊断，但仍有部分难区分良、恶性.胸膜活检虽可信，但有创伤、阳性率低.为此人们尝试胸水细胞染色体畸变率、p53突变作为辅助诊断指标［1-5］ ，但需专门培训.微核检测简便、快速，是染色体损伤和染色体畸变的可靠替代指标.近些年研究发现多种肿瘤患者外周血淋巴细胞微核率（PBLMNF）及脱落细胞微核率增高［6-9］ ，肿瘤患者诱发微核率增加显著高于正常人，表明肿瘤患者染色体稳定性差
［10，11］ .提示PBLMNF是潜在的肿瘤诊断的辅助指标.我们采用改良的Fenech［12］ 创建的胞质分裂阻滞法检测胸水患者自发及丝裂霉素诱发PBLMNF，直接在光镜下观察胸水淋巴细胞微核率（PFLMNF），了解PFLMNF能否反应PBLMNF，探讨PFLMNF检测及诱发微核试验在良、恶性胸腔积液鉴别诊断中的价值.
1 对象和方法
1.1 对象 实验分3组，即恶性胸腔积液组、良性胸腔积液组及健康对照组.①恶性胸腔积液组（A组）20（男13，女7）例.年龄28～67（平均46.7±11.4）岁.其中肺癌14例，胸膜间皮瘤3例，乳腺癌胸膜转移1例，肝癌胸膜转移2例.全部经病理细胞学确诊.实验前均未作化疗、放疗.②良性胸腔积液组（B组）20（男10，女10）例，年龄22～71（平均46.5±14.8）岁，结核性胸膜炎16例，根据临床表现、胸水生化检查及治疗结果确诊.系统性红斑狼疮胸腔积液1例，经血液狼疮细胞多次检查确诊.肝硬化低蛋白血症胸腔积液3例，根据临床表现、肝功检查、胸腔积液检查确诊.③健康对照组（C组）20（男13，女7）例，年龄26～71（平均46.5±11.7）岁.胸腔积液患者均为住院确诊患者，标本为入院后未作治疗的前两次胸腔积液.3组人群均无遗传性疾病，实验前1wk无服用致畸化学药物及反复放射线大量接触史.
1.2 方法
1.2.1 外周血淋巴细胞自发微核 取肝素抗凝血0.5mL加入含200mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液5mL（内含双抗各1×105 U・L-1 ），加入终浓度为2g・L-1 PHA（植物血凝素）.50mL・L-1 CO2 恒温培养箱37.0℃培养36h，加入终浓度为6mg・L-1 的细胞松弛素B，继续培养36h.培养物移入10mL刻度离心管中，1000r・min-1 离心8min（以下均相同）.弃上清液加入0.1mol・L-1 的KCl溶液3mL，37.0℃低渗3min，随后加入新配制甲醇:冰醋酸（3∶1）固定液2mL轻轻吹匀预固定，离心弃上清液.加固定液5mL固定20min，离心弃上清液.加少许固定液吹匀沉淀，3～4滴滴于冰冻载玻片上，由一端向另一端吹匀，气干.Giemsa-Wright（pH6.8）复染15min.
1.2.2 体外淋巴细胞诱发微核 0.5mL肝素抗凝血培养前加入终浓度为0.1mg・L-1 丝裂霉素C，其余实验步骤同上.
1.2.3 胸腔积液淋巴细胞微核 抽胸腔积液50mL，离心弃上清液，生理盐水30mL冲洗沉淀物并离心弃上清液，重复1次.沉淀物加入0.1mol・L-1 KCl溶液10mL混匀低渗处理3min，加入新配固定液（同前）10mL预固定，离心弃上清液.加少许固定液冲匀沉淀物并移入10mL刻度离心管中，加固定液到10mL，固定20min，离心、滴片、染色同前.
1.3 微核观察
1.3.1 外周血淋巴细胞片 高倍镜下（10×40倍）每例计数1000个胞膜完整的双核淋巴细胞，计算微核细胞率，以‰率表示.
1.3.2 胸腔积液片 高倍镜下（10×40倍）每例计数1000个胞膜完整、染色清晰的淋巴细胞，计算微核细胞率，以‰率表示.
1.3.3 微核判定标准［12］ 微核呈圆形或椭圆形，直径为主核的1/16～1/3，且无折光性，与主核不相连， 染色与主核一致或稍淡.
统计学处理:数据用x ±s表示，应用SPSS统计软件，年龄、性别比、吸烟量采用方差分析，组间、组内微核率比较采用t检验.
2 结果
2.1 一般情况比较 3组人群年龄、性别、吸烟量方差分析无统计学差异（P&>0.05，Tab1）.
2.2 微核率比较及相关性分析 良性胸腔积液组PBLMNF与对照组无统计学差异（P&>0.05）;恶性胸腔积液组与良性胸腔积液组及对照组差异显著（P&<0.01）.各组MMC诱发微核率明显增高，恶性胸腔积液组尤为显著（P&<0.01）.PFLMNF较PBLMNF低（P&<0.01）.恶性胸腔积液组PFLMNF明显高于良性胸腔积液组（P&<0.01）.各组内诱发PBLMNF高于自发PBLMNF（P&<0.01），自发PBLMNF明显高于PFLMNF（P&<0.01，Tab2）.PFLMNF与PBLMNF间有很好的相关性（r=0.935，P&<0.01）. 表1 3组年龄、性别比例、吸烟量方差分析 略
表2 3组外周血淋巴细胞自发、诱发微核率及胸腔积液淋巴细胞微核率比较 略
3 讨论
微核是有丝分裂后期滞留于胞质中的染色体片段或染色单体，主要由染色体断裂、非整倍体化形成.正常人姊妹染色体之间由于遗传稳定性及进化需要而经常发生互换，在分裂间期由于染色体断裂、纺锤体功能受损或纺锤体与染色体联接障碍，断裂及与纺锤体联接障碍染色体、功能受损纺锤体所联接染色体则在分裂后不能包被在子核中而形成微核.但由于正常人染色体修复机制完好大部分可修复，部分严重染色体损伤细胞则起动细胞凋亡，因而正常人微核率极低.微核作为染色体损伤的一种标志，目前广泛用于放射损伤和诱变剂检测，也是染色体稳定性的可靠性指标12，13］ .MMC是一种常用细胞遗传学研究用诱变剂，其与DNA双链结合成交联复合物，使修复过程中的DNA链断端重接错误，并干扰DNA包裹过程导致染色体畸变［14］ .因此根据MMC诱发微核增加程度可间接反应出细胞对DNA损伤修复能力.Adhvaryu等［6］ 观察口腔癌患者和咀嚼槟榔烟者口腔粘膜刮片及外周血淋巴细胞，发现癌症患者及嚼烟者粘膜细胞微核及淋巴细胞染色体畸变率明显高于正常人，表明嚼烟者可能更易患癌.Cerqueira等［8］ 观察了一组子宫颈癌及炎症患者子宫颈刮片微核，结果癌症患者及癌前病变炎症者微核率明显增高.Duf-faud等［7］ 和Venkatachalam等［9］ 观察癌症治疗前患者外周淋巴细胞微核率明显高于正常人.Roser等［10］ 和Weichenthal等［11］ 研究了表皮黑色素瘤患者成纤维细胞及淋巴细胞自发微核和紫外线照射诱发成纤维细胞微核率及姊妹染色体交换率，结果均明显高于正常人，有家族史者自发及诱发微核率增加尤为显著，表明染色体不稳定性是其遗传易感性的重要原因.我们观察恶性胸水患者外周血淋巴细胞自发微核率及诱发微核率均较良性胸水组及对照组明显升高（P&<0.01），恶性胸腔积液组PFLMNF亦较良性胸水组高，而良性胸腔积液组血自发微核率与对照组无统计学差异，表明恶性胸腔积液患者染色体不稳定性即染色体脆性增加.MMC诱发微核率绝对值升高较良性胸腔积液组及对照组明显，表明肿瘤患者染色体对MMC等诱变剂更加敏感，提示其染色体修复功能缺陷.从而从机制上说明恶性胸腔积液患者微核率较正常人增加是其染色体脆性增加伴修复能力下降的结果.因此，从本研究结果提示自发及诱发微核率反应的患者染色体稳定性可作为恶性胸腔积液易感性的一项指标.同时观察的胸腔积液微核率较PBLMNF明显减低可能为含微核淋巴细胞进入胸腔后凋亡或自身染色体修复或将微核排出胞外.PFLMNF与PBLMNF有很好的相关性（r=0.935），恶性胸腔积液组PFLMNF明显高于良性胸腔积液组，与PBLMNF结果一致，提示胸腔积液淋 巴细胞微核率可较好地反应PBLMNF，可替代PBLMNF检测.表明其在胸腔积液良、恶性鉴别诊断中具有重要的意义.胸腔积液取材方便、快速，而且微核率检测方法也简单易行，这为临床工作提供了方便.因此，我们认为胸腔积液淋巴细胞微核率检查有望成为一种作为胸腔积液良、恶性鉴别的一项有实用价值辅助性指标.
参考文献
［1］Atalay F，Baltaci V，Alpas I，Savas I，Atikcan S，Balci S.Sis-ter chromatid exchange rate from pleural fluid cells in patients with malignant mesothelioma ［J］.Mutat Res，2000;465（1-2）:159-163.
［2］Ishihara T，Moore GE，Sandberg AA.Chromosome constitu-tion of cells in effusions of cancer patients ［J］.J Natl Cancer Inst，1961;27:893-933.
［3］Watts KC，Boyo-Ekwueme H，To A，Posnansky M，Coleman DV.Chromosome studies on cells cultured from serous effu-sions:Use in routine cytologic practice ［J］.Acta Cytol，1983;27（1）:38-44.
［4］Chen ZS，Ye JH.Chromosome aberration observation in pleural effusions and ascites with tumor ［J］.ChungHua Ihsueh IchuanHsueh TsaChih（Chin J Med genet），1999;16（2）:132.
［5］Zhang HL，Wang WL，Min J.Detection of mutant p53gene in pleural effusion cells with PCR-SSCP ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（7）:869-871.
［6］Adhvaryu SG，Dave BJ，Trivedi AH.Cytogenetic surveillance of tobacco-areca nut（mava）chewers，including patients with o-ral cancers and premalignant conditions ［J］.Mutat Res，1991;261（1）:41-49.
［7］Duffaud F，Orsiere T，Villani P，Pelissier AL，Volot F，Favre R，Botta A.Comparison between micronucleated lymphocyte rates observed in healthy subjects and cancer patients ［J］.Mu-tagenesis，1997;12（4）:227-231.
［8］Cerqueira EM，Santoro CL，Donozo NF，Freitas BA，Pereira CA，Bevilacqua RG，Machado-Santelli GM.Genetic damage in exfoliated cells of the uterine cervix.Association and interaction between cigarette smoking and progression to malignant trans-formation?［J］.Acta Cytol，1998;42（3）:639-649.
［9］Venkatachalam P，Paul SF，Mohankumar MN，Prabhu BK，Gajendiran N，Kathiresan A，Jeevanram RK.Higher frequency of dicentrics and micronuclei in peripheral blood lymphocytes of cancer patients ［J］.Mutat Res，1999;425（1）:1-8.
［10］Roser M，Bohm A，Oldigs M，Weichenthal M，Reimers U，Schmidt-Preuss U，Breitbart EW，Rudiger HW.Ultraviolet-in-duced formation of micronuclei and sister chromatid exchange in cultured fibroblasts of patients with cutaneous malignant melanoma ［J］.Cancer Genet Cytogenet，1989;41（1）:129-137.
［11］Weichenthal M，Roser M，Ehlert U，Frenzer S，Breitbart E，Rudiger HW.Increased numbers of spontaneous micronuclei in blood lymphocytes and cultures fibroblasts of inpiduals with familial cutaneous malignant melanoma ［J］.J Cancer Res Clin Oncol，1989;115（3）:264-268.
［12］Fenech M.The cytokinesis-block micronucleus technique:A de-tailed description of the method and its application to genotoxici-ty studies in human populations ［J］.MutatRes，1993;285:35-44.
［13］Hsu TC，Spitz MR，Schantz SP.Mutagen sensitivity:A biolog-ical marker of cancer susceptibility ［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，1991;1（1）:83-89.
［14］Ishii Y.Nature of the mitomycin-C induced lesion causing sister-chromatid exchange ［J］.Mutat Res，1981;91（1）:51-55.