【关键词】 内皮细胞
关键词: 内皮细胞;体外模型;牛血清白蛋白;血迷路屏障;豚鼠
摘 要:目的 研究豚鼠血迷路屏障通透性体外模型的建立方法及其通透性特征. 方法 ①用组织块贴壁培养法分离培养豚鼠耳蜗微血管内皮细胞，免疫组化法进行鉴定;②用小池技术建立起内皮细胞通透性的体外模型，并研究该模型中耳蜗、脑及肺3种内皮细胞对125 I-牛血清白蛋白的通透性;③研究豚鼠血迷路屏障对125 I-牛血清白蛋白的通透性. 结果 ①培养细胞致密融合时具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观，经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子，95%以上的培养细胞的胞质中呈棕黄色阳性反应;②耳蜗、脑及肺3种内皮细胞的体外模型中加入125 I-牛血清白蛋白后，贝克-时间变化图均呈抛物线型上升曲线，90min内几乎呈直线;③豚鼠血迷路屏障对125 I-牛血清白蛋白的通透性曲线与体外模型相似. 结论 血迷路屏障的体外模型能大体反映在体时的通透性特征.
Keywords:endothelial cell;model in vitro;bovine serum al-bum;blood labyrinth barrier;guinea pig
Abstract:AIM To study the method of setting up model in vitro for the permeability of blood labyrinth barrier from guinea pigs and the model’s permeability.METHODS ①Cochlear microvascular endothelial cells（CMEC）from guinea pigs were isolated and cultured by tissue nubbles culti-vation and were identified with immunohistochemical test，and the model in vitro for the permeability of CMEC was es-tablished using small pool technique;②Researched the model’s permeability on radioiodinated125 I bovine serum al-bum（RISA）;③Studied the permeability on RISA of blood labyrinth barrier from guinea pigs in vivo.RESULTS ①The monolayer confluent cells showed typical“flagstone”ap-pearance as cultured endothelial cells，according to immuno-histochemical detection of factor VIII，which is the mark antigen of endothelial cell，over95%cells were observed the positive reaction with cytoplasmic buffy pigsmenting;②Af-ter RISA administration，the Bake-time curve of the model took on an ascending parabola，while within90min appeared like a straight line;③Permeability curve on RISA of the model in vitro simillar to that of blood labyrinth barrier in vi┐vo.CONCLUSION The model in vitro of blood labyrinth barrier reveals the permeability of in vivo.
0 引言
血迷路屏障的作用在于保持迷路液成分的稳定，从而保证内耳行使正常生理功能，同时其通透性异常也是某些内耳疾病发病机制的重要环节，因此，研究血迷路屏障的通透性的调控机制具有重要的临床意义.但是，截止目前在活体动物上开展的相关研究工作中，尚未能取得有意义的进展［1］ .耳蜗血管纹等特定部位的微血管内皮细胞是构成血迷路屏障的基础，本研究在分离培养豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的基础上，建立起了该屏障通透性的体外模型，并将这一体外模型对125 I标记的牛血清白蛋白的通透性与肺和脑微血管内皮细胞，以及与活体动物的通透性进行了对照研究，为今后进一步探索血迷路屏障的体外调控机制打下了良好的基础.
1 材料和方法
1.1 材料 ①兔抗人八因子相关抗原（Ⅷ-R Ag）多克隆抗体试剂盒由北京中山生物技术有限公司生产.②Millicell，底部为多聚醋酸酯滤膜的培养碟，底面积为4.2cm2 ，微孔直径为0.4μm由Millipore公司生产，使用前滤膜上分别涂以醋酸鼠尾胶原和粘连蛋白（Roche）液.③碘化钠（Na125 I）购于中国核动力研究设计院第一研究所.将牛血清白蛋白溶于PBS中，加入氧化剂氯甘脲后注入Na125 I震荡、上柱、层析、分离，收集产品配成放射浓度为3.7MBq・mL-1 的工作液.
1.2 方法
1.2.1 豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的分离培养及鉴定［2，3］ 选取200g左右的正常杂色豚鼠10只，麻醉，断头，取出听泡，用750mL・L-1 乙醇浸泡5min，冲洗浸入D-Hanks液中，解剖显微镜下完整剥离出耳蜗外侧壁软组织，分离出含深色色素的血管纹，并将其切碎成0.5mm大小的微小组织块，均匀平铺于直径35mm的培养皿底.贴壁牢固后，向培养皿中加入含有250mL・L-1 胎牛血清（hyclone）的DMEM（hyclone）细胞培养液，置50mL・L-1 CO2 ，37℃培养箱中进行培养.发现有细胞自组织块边缘长出后，6d时刮除所有组织块.待细胞集落增殖到有足够数量后开始首次传代:D-Hanks液冲洗，2.5g・L-1 胰蛋白酶-0.1mL・L-1 EDTA细胞消化液（Sigma）消化，待大部分细胞脱壁后，含胎牛血清的培养液中止消化，将细胞悬液离心，弃去上清液后加血清培养液，接种于25mL的培养瓶中继续培养，细胞接种密度为（2～3）×105 ・cm-2 .
在细胞传代过程中，细胞消化后只留取贴壁较快的约3/4的培养细胞.细胞接种时，只留取约3/4的贴壁较快的细胞继续培养.每次传代后，倒置显微镜下用细胞擦刮去已贴壁的可疑杂细胞.前三代细胞传代时连续进行上述操作，对内皮细胞进行纯化.
培养皿底放入盖玻片，将纯化的培养细胞接种其中，待细胞到达合适密度后，40g・L-1 多聚甲醛固定，依次滴加过氧化物酶阻断液（30mL・L-1 h3 O2 ，甲醇配制），正常山羊血清，1∶100兔抗人Ⅷ因子多克隆抗体（一抗），生物素标记的1∶100二抗工作液（通用型IgG/Bio），辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素1∶100工作液，然后用DAB显色液显色，封片观察.同时用大鼠肝细胞作阴性对照，用PBS代替Ⅷ因子抗体作空白性对照，其余步骤不变.
1.2.2 微血管内皮细胞通透性体外模型的构建 该模型由内池和外池两部分组成.内池为Millicell，外池为6孔培养板的培养孔.使用时将Millicell放入培养孔中，60 Co照射灭菌后，向内池中接种入内皮细 胞悬液（细胞密度5×104 ・cm-2 ），尔后向内、外池中加入血清培养液后置CO2 孵箱中培养，7～8d时，观察内皮细胞已完全形成致密融合的单层时，该系统即为内皮细胞通透性体外模型［4］ ，待用.
1.2.3 体外模型对RISA的通透性 取待用模型，向内池和外池中分别加不含血清的DMEM培养液，同时向内池中加入RISA工作液3mL11.1MBq，放入50mL・L-1 CO2 ，37℃之培养箱中培养，分别于15，30，45，60，75，90，120和240min时从外池中取液5μL，及时检测其每分钟放射强度计数，计算出其放射活度值，绘制时间-通透性曲线［5］ .
本研究分别用豚鼠脑微血管内皮细胞（按Diglio等［6］ 的方法培养获得）、兔肺微血管内皮细胞（从APCC购买）及未接种细胞的Millicell滤膜作阳性、阴性和空白对照，样本数均为6.
1.2.4 豚鼠活体血迷路屏障对牛血清白蛋白-125 I的通透性 选取2mo龄，质量200～300g的正常杂色豚鼠48只，雌雄不限.全部动物用乌拉坦按1.5g・kg-1 的剂量ip麻醉，切开颈部皮肤显露颈静脉，按5.55MBq・kg-1 的剂量向静脉中注入RISA工作液，1，2，3，4，5，6，12和18h后随机抽取6只动物作为一组，断头，取出听泡，剪去听泡骨壁，钩破前庭窗并扩大，微量取样器吸出迷路液5μL，立即作每分钟放射强度计数，计算出放射活度值，绘制时间-通透性曲线［5］ .
2 结果
2.1 培养细胞的形态学观察及鉴定 耳蜗血管纹组织块培养后2d，部分组织块边缘可见有细胞生长，10d以后增殖成数个较大的细胞集落.初期细胞呈梭形及多边形，其间夹杂着少数杂细胞，原代细胞经消化接种后，用台盼蓝排阻法鉴定细胞存活率约90%.
培养细胞纯化后，以多边形为主，7～8d形成致密融合的单层，呈现出内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观（Fig1）.经免疫组化法检测其标志性抗原Ⅷ因子，95%以上的培养细胞胞质内有棕黄色着色，呈阳性反应（Fig2）. 转贴于 2.2 内皮细胞通透性体外模型对RISA的通透性 观察Fig3，可发现曲线均呈上升趋势，经统计学（SSPS10.0软件）各种曲线拟合，均以二次曲线拟合最佳.同时前9min内上升几乎呈直线，可得到直线回归方程.经方差分析，实验组与阳性对照组相差显著（P&<0.05），与阴性对照组及空白对照组相差非常显著（P&<0.01）.
2.3 豚鼠血迷路屏障对RISA的通透性 观察分析该散点图，可发现呈抛物线型曲线，其中前6h内几乎呈直线上升，12h到达峰值，此后呈较快下降，提示该通透性曲线在6h内直线化上升，12h内则呈上升的双曲线，整条曲线则为3次抛物线，经统计学处理后能分别得到直线、双曲线及三次抛物线方程（Fig4）.
图1 － 图4 略
3 讨论
自20世纪60年代，国外学者提出血迷路屏障的概念并被普遍接受以来，国内外对该屏障进行了大量研究，并取得一些进展.但由于受到在体（in vivo）研究技术手段的限制，均未能对其病理生理学进行更深入的探索，更无法利用调控其通透性的方法对这类内耳疾病进行防治，未能达到指导临床应用的目的.国外学者通过研究证实，血迷路屏障同血脑屏障等其他屏障系统一样，是以毛细血管内皮细胞及其连结为基础而构成的物质交换机制的集合，因此，研究血迷路屏障的关键是研究耳蜗微血管内皮细胞的通透性.近年来，由于活体组织毛细血管内皮细胞分离及培养技术的发展，通过获取体外培养的单层融合内皮细胞，一些器官血管内皮细胞通透性的体外模型不断建立成功，被多数学者广泛用于外周器官血管内皮细胞通透性和血脑屏障通透性的调控机制及药理学研究，并取得了许多重要进展［7］ ，但迄今国内外尚未见耳蜗微血管内皮细胞通透性体外模型的研究报告［7］ .
由于内耳结构复杂，豚鼠中毛细血管量少，所以取得耳蜗微血管内皮细胞有较大困难.在本研究中，作者应用显微解剖分离技术出耳蜗血管纹后，采用微小组织块贴壁培养法，再结合应用差别纯化技术，国内外首次成功分离培养了所需要的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞［8］ .分离纯化后的培养细胞，形态基本一致，多数呈多边形，单层融合状态下具有内皮细胞培养时典型的“铺路石”样外观，经免疫组化法鉴定，95%以上的细胞胞质中含有内皮细胞的标志性抗原Ⅷ因子，表明作者培养的细胞是基本纯净的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞［9］ .
在参照国外研究血脑屏障通透性体外模型技术方法的基础上［10］ ，作者采用小池技术，将内皮细胞接种在经鼠尾胶原及粘连蛋白处理后的Millicell上，使细胞顺利贴壁，单层生长，底层滤膜经透明化处理后，能够对细胞生长及融合情况进行观察，满足了实验需要.该方法建立的内皮细胞通透性的体外模型，在对RISA通透性的研究中表明，耳蜗内皮细胞的通透性，大于脑灰质内皮细胞，但明显小于肺内皮细胞，这一结果与Juhn等［1］ 在活体动物上的研究结论一致.同时，牛RISA在该CMEC通透性的体外模型中的通透性曲线，亦与其在动物血迷路屏障中的通透性曲线非常相似（12h内），都呈现先快后慢的上升型曲线，都能进行最佳的二次曲线拟合.另外，本研究中豚鼠血迷路屏障对牛RISA的通透性曲线，与以前该项研究中［9］ 所得到的曲线基本相同，从而证明，本研究建立的耳蜗微血管内皮细胞通透性的体外模型，基本上反映了其在机体内的机能状态，适用于离体（in vitro）开展血迷路屏障的某些通透性研究.
参考文献
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